血清乙酰肝素酶、α-L-巖藻糖苷酶和胱抑素C預測2型糖尿病患者早期腎損害臨床價值對比研究

張桐慧,王 玲，陳 玲

錦州醫科大學附屬第一醫院(錦州121000)

糖尿病腎病是糖尿病常見的微血管并發癥，同時也是慢性不可逆的并發癥，不僅影響糖尿病患者生活質量，也是致其死亡的主要原因。糖尿病腎病的發生機制仍不明確，有證據顯示糖尿病患者長期呈高血糖狀態，α-L-巖藻糖苷酶及乙酰肝素酶活性增強。國外實驗報道證實，通過eNOS/NO通路誘導乙酰肝素酶的表達，會增強硫酸乙酰蛋白多糖的降解[1]，出現腎小球基底膜電荷屏障受損，導致蛋白尿的出現。微量白蛋白尿的出現預示糖尿病腎病的發生和腎功能的下降[2-3]。因此蛋白尿/肌酐比值被廣泛應用于臨床上糖尿病腎病的診斷。有部分糖尿病患者，在蛋白尿出現之前就存在腎損害，而糖尿病早期腎損害的標志物研究較少，因此本研究擬檢測受試者血清α-L-巖藻糖苷酶、乙酰肝素酶及胱抑素C水平，并與蛋白尿進行對比，探索其在糖尿病早期腎損害中的臨床應用價值。

對象與方法

1 研究對象 根據WHO糖尿病診斷和分型標準[4]，收集2018 年 6 月至 2019年 6 月就診于錦州醫科大學附屬第一醫院收治的2 型糖尿病患者 120例。所有參與者都獲得了書面知情同意書，研究得到了醫院倫理委員會的批準。120例患者中，男性63例，女性57例，年齡21～74歲。根據24 h尿蛋白排泄率(UAER)將患者分為三組：單純糖尿病組(SDM)24 h尿蛋白排泄率<30 mg，早期糖尿病腎病組(EDKD)，24 h尿蛋白排泄率30～300 mg，臨床糖尿病腎病組(CDKD)24 h尿蛋白排泄率>300 mg。病例納入標準：①年齡≥ 18 歲；②符合WHO 糖尿病診斷標準；③近期未使用降脂、降壓、腎毒性藥。排除標準：①1型糖尿??；②糖尿病急性并發癥；③心腦血管病急性期、輸血史，貧血，風濕性疾病，腫瘤、放化療患者；④服用激素及腎毒性藥物或近期服用抗生素者；⑤近3個月內有過外科手術史、消化道出血史；器官移植者；肝功能不全、嚴重創傷及感染、應激等情況者；⑥孕婦及哺乳期患者；⑦生理性蛋白尿或其他腎病。

2 研究方法 所有入選對象均于清晨抽取靜脈血液立即送檢空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血肌酐(Scr)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、α-L-巖藻糖苷酶(AFU)、乙酰肝素酶(HPA)、胱抑素C(Cys-C)、尿微量白蛋白(mALB)、24 h尿蛋白排泄率(UAER)。AFU、Scr、HDL-C、LDL-C、TC、TG均由日立008均全自動生化儀化驗，采用儀酶法測定。Cys-C采用免疫比濁法測定。 HbA1c由日本HLC-高G8化驗，均采用日本和光原裝試劑盒。 HPA采用ABC-ELISA法。尿白蛋白的測定采用散色比濁法測定。eGFR(ml/min/1.73m2)=186×Scr^1.54×年齡^0.203(女性×0.742)(利用MDRD公式計算)。

3 統計學方法 選用 SPSS 25.0 統計學軟件。計量資料以均數±標準差表示。符合正態分布及方差齊性的變量采用多因素方差分析，非正態分布的變量采用Kruskal-Wallis H檢驗(組間比較采用百分位數)。相關性分析采用Pearson相關系數，當r0.4～0.6提示中等相關，當r0.6～0.8提示強相關；當r為0.8～1.0提示極強相關。研究指標預測糖尿病早期腎損害的特異度和靈敏度采用受試者工作特征(ROC)曲線分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 基本資料 對本研究納入的120例受試者收集基本資料，并進行統計學分析得出：各組間年齡比較差異無統計學意義，各組間BMI比較無統計學差異。CDKD組病程及收縮壓與SDM組及EDKD組比較有統計學差異(P<0.05)，即糖尿病各組的病程、收縮壓隨DKD的嚴重程度逐漸增加。EDKD組舒張壓與SDM組及CDKD組比較，無統計學差異。見表1。

表1 各組基線資料比較

注：EDKD組與SDM組比較，#P<0.05 ；CDKD組與SDM組比較，*P<0.05；EDKD組與CDKD組比較，●P<0.05；與SDM組比較，△P>0.05

2 對臨床及實驗室數據行方差分析及Kruskal-Wallis H 檢驗 三組間AFU、HPA、CysC-C、Scr、eGFR、mALB、UAER、HbA1c、HDL-C、LDL-C、TC比較均有統計學差異(P<0.05)，而FPG、TG比較無統計學差異(P>0.05)。反映腎功能指標：EDKD組AFU大于SDM組(P=0.005)、CDKD組(P=0.001)；CDKD組AFU低于SDM組、CDKD組(P<0.001)。CDKD組HPA大于SDM組(P<0.001)、EDKD組(P<0.001)；EDKD組大于SDM組(P=0.002)。CDKD組Cys-C大于SDM組(P<0.001)、EDKD組(P<0.001)；SDM組與EDKD組比較無統計學差異。CDKD組Scr大于SDM組(P<0.001)、EDKD組(P<0.001)；SDM組與EDKD組比較無統計學差異。見表2。

表2 對臨床及實驗室數據行方差分析及Kruskal-Wallis H 檢驗

3 腎損傷指標與其他參數的相關性分析 從整體水平上AFU、HPA、Cys-C與UAER的相關系數r分別為-0.411、0.865、0.837，以HPA與UAER相關性最佳，Cys-C次之，而AFU表現為中等相關；而AFU、HPA、Cys-C與eGFR的相關系數r分別為0.228、-0.716、-0.772，以Cys-C與eGFR相關性最佳，HPA次之，而AFU與eGFR相關性差。見表3。

表3 腎損傷指標與其他參數的相關性分析

注：r值0.4～0.6中等相關，0.6～0.8強相關，0.8～1.0極強相關

4 ROC曲線分析 以UAER(30～300 mg/24 h)為診斷EDKD的標準，ROC曲線用AFU預測早期糖尿病腎損害，其靈敏度是60%，特異度是77.5%(ROC曲線下面積是0.728，P<0.001)；ROC曲線用HPA預測早期糖尿病腎損害，其靈敏度是62.5%，特異度是95%(ROC曲線下面積是0.813，P<0.001)；ROC曲線用Cys-C預測早期糖尿病腎損害，其靈敏度是27.5%，特異度是88%(ROC曲線下面積是0.624，P<0.001)(圖1)。

圖1 預測糖尿病早期腎損害ROC曲線

討 論

雖然糖尿病腎病的確切原因尚不清楚，但已經假定了幾種機制，如高血糖誘導的腎損害，晚期糖基化誘導的氧化應激增加，蛋白激酶C誘導的細胞因子增多，激活多元醇途徑，趨化因子，以及不同的炎癥和凋亡信號。在各種因素中，已經提出氧化應激在糖尿病腎病的發生和發展中起主要作用[5]。TNF-α、IL-1等炎癥因子及高血糖狀態可以誘導晚期糖基化終產物，影響蛋白質的壽命，特別是基底膜成分如硫酸乙酰蛋白多糖。硫酸乙酰肝素蛋白多糖是維持腎小球基底膜電荷屏障的重要組成成分。乙酰肝素酶(HPA)降解蛋白多糖，導致腎小球電荷屏障及結構屏障破壞，出現蛋白尿。國外報道[6-8]，溶酶體自噬功能對晚期糖基化終產物的降解起著至關重要的作用。α-L-巖藻糖苷酶(AFU)作為溶酶體酶，血清檢測其升高對提示溶酶體自噬功能下降有一定的價值和幫助[9]。已有諸多研究證實，HPA及AFU可能通過特異性降解基底膜硫酸乙酰蛋白多糖陰離子HS側鏈，破壞腎小球基底膜電荷屏障，從而導致蛋白質的漏出，產生微量蛋白尿[6,10]。糖尿病導致腎損害，影響腎小管的重吸收功能，Cys-C在近曲小管的重吸收及降解功能受到影響，導致血液中Cys-C的蓄積，因此血清Cys-C升高。

綜上所述，糖尿病患者在長期高血糖狀態下，激活多元醇途徑，誘導AFU活性增強，同時晚期糖基化終產物增多，加快硫酸乙酰蛋白多糖的降解，從而HPA活性增強，腎小球基底膜屏障作用進一步破壞，出現蛋白尿，標志糖尿病腎損害的發生[11]。因此，及早地發現和阻斷蛋白尿的出現顯得至關重要，本研究設想在糖尿病患者尚未出現蛋白尿之前，通過聯合檢測血清中AFU及HPA預測糖尿病患者的早期腎損害，提供臨床新的診斷思路及標志物[12-13]。糖尿病患者早期腎損害并不完全出現蛋白尿，因此探索新的腎損傷標志物顯得尤為重要[14-15]。

本研究將實驗組分為三組，即單純2型糖尿病組、早期糖尿病組和臨床糖尿病腎病組，并對患者血清AFU、HPA及Cys-C水平進行檢測，同時對其臨床意義進行研究。結果顯示，AFU及HPA在早期糖尿病組升高明顯，而Cys-C在臨床糖尿病腎病組升高明顯；血清AFU水平在早期糖尿病組明顯高于其他組，并與BMI呈正相關，這與張可[16]等研究呈一致性。而與整體UAER水平呈負相關，即隨著蛋白尿的大量出現，AFU并沒有明顯的升高趨勢，原因尚不明確，可能與高血糖狀態下誘導晚期糖基化終產物有關，而降解蛋白多糖的程度有待證實。血清HPA、Cys-C水平的升高與病情程度顯著相關，并與HbA1c、mALB、UAER呈正相關。同時，通過對比各組血清HPA水平變化發現，伴隨2型糖尿病患者尿白蛋白排泄率的增加，血清HPA水平有顯著升高，分析其原因是：晚期糖基化終產物在高血糖狀態下不斷累積，通過NF-κB信號通路誘導足細胞乙酰肝素酶的表達，降解乙酰肝素蛋白多糖，出現蛋白尿[17]。Cys-C應用在糖尿病患者的優勢表現在與Scr及eGFR的相關性最強，因此Cys-C在預測腎小球濾過功能上有顯著的應用價值。胱抑素C作為一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，已被臨床廣泛作為腎小球及腎小管損傷的標志物。Siddiqi及Colhoun等人在他們的研究中發現，糖尿病患者血清Cys-C水平與尿蛋白/肌酐比值呈正相關。并有其他研究報道指出，有望將尿Cys-C作為2型糖尿病患者早期腎損害的標志物[18-19]。

ROC曲線分析證實，AFU及HPA在預測糖尿病早期腎損害上有較高的敏感度及特異度，如果以血清AFU作為預測糖尿病早期腎損害的標志物，根據ROC曲線結果分析，其靈敏度60%，特異度77.5%；如果以血清HPA作為預測糖尿病早期腎損害的標志物，根據ROC曲線結果分析，靈敏度是62.5%，特異度是95%。聯合檢測二者水平較單一檢測血清Cys-C水平有明顯優越性，有望作為預測糖尿病早期腎損害的標志物，為臨床工作提供新思路。