陜西民間醋醅中高產酸醋酸菌的篩選和發酵特性

謝錦明，趙秀芳，袁江蘭，康旭

(湖北工業大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢，430068)

中國是食醋釀造大國，有幾千年的釀醋歷史。傳統的食醋發酵工藝為固態發酵[1]，但隨著現代生物技術的發展，液態深層發酵法因生產周期短、產品穩定、產量高、成本低等優點[2-3]受到眾多食醋企業的青睞[4]。醋酸菌菌種是影響液態深層發酵醋品質的主要因素[5]，目前中國釀醋工業常用的醋酸菌為巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)，如 AS1.41和滬釀1.01[6]，但是它們的產酸能力不高且條件耐受性不強，影響了液態深層發酵醋的品質[7]。因此，篩選產酸能力強且條件耐受性好的醋酸菌，對促進我國食醋產業的發展具有重要意義[8]。

從中國民間或工業醋醅中篩選優良醋酸菌，是當前研究熱點之一[9]，近年來，關于這方面的研究報道較多。劉陽[10]等從保寧醋曲篩選出1株產酸量為54.28 g/L、乙醇和乙酸耐受性較好的醋酸桿菌。CHEN等[11]從工業醋醅中篩選出1株產酸量高達61.2 g/L的巴氏醋酸桿菌，并且可以耐受體積分數為12%的乙醇和42 ℃的高溫，具有潛在應用價值。

中國陜西民間有釀醋的習俗，因此民間醋醅資源豐富，是篩選醋酸菌的良好來源，但這方面鮮有研究報道。本研究采集到一種評價良好的陜西民間醋醅，通過初篩和復篩從中篩選高產酸醋酸菌，并與應用廣泛的醋酸菌菌種AS1.41進行深層發酵特性比較，然后將比較得到的最優菌株進行16S rDNA同源序列分析鑒定。本研究旨在獲得高產醋酸且具有較好耐受性的醋酸菌菌株，為推進醋酸行業的發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋醅樣品，取自陜西民間。菌株為巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)AS1.41，湖北工業大學實驗室保藏菌種。

CaCO3(輕質，99%)，上海麥克林；酵母提取物(YEAST EXTRACT)，Oxid; 葡萄糖、無水乙醇、NaOH、酚酞、FeCl3等(均為分析純)、瓊脂條(BR)，國藥集團化學試劑有限公司。

LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司； HNY恒溫培養振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；303電熱培養箱，上海浦東榮豐科學儀器有限公司；TGL-18M臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 培養基

富集培養基(GYa)：10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、體積分數為2%的無水乙醇。

分離培養基(GYb)：10 g/L葡萄糖、110 g/L酵母提取物、20 g/L CaCO3、20 g/L瓊脂、體積分數為3%的無水乙醇。

種子培養基(GYc)：10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、體積分數為3.6%的無水乙醇。

發酵培養基(GYd)：10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物。使用前，根據實驗設計添加不同體積分數的無水乙醇。

以上培養基使用前，均在0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 醋醅中醋酸菌的富集培養

采集新鮮的陜西民間醋醅，于4 ℃下保存。首先富集醋醅中醋酸菌。在250 mL搖瓶中，醋醅與GYa培養基按1∶20的質量比稀釋至100 mL， 30 ℃、 180 r/min富集培養48 h，使醋酸菌快速增殖。

1.3.2 醋酸菌的初篩

在滅菌后熱的GYb培養基添加體積分數為3%的無水乙醇，倒平板。用無菌生理鹽水將富集的醋醅醋酸菌培養液進行梯度稀釋，分別取 10-5、10-6和10-7稀釋度培養液200 μL涂布于篩選平板上，30 ℃培養72 h。挑取透明圈直徑比大的單菌落進行劃線分離，4 ℃下斜面保存。

1.3.3 醋酸菌的復篩

斜面保藏的分離菌株進行革蘭氏染色試驗[12]和產酸定性試驗[13]。產酸定性試驗操作為將分離菌株接種于GYc培養基中，30 ℃、180 r/min搖瓶培養72 h。然后取10 mL培養液5 000 r/min離心10 min，取5 mL 上清液用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH至7.0，然后煮沸，加入5滴0.1 mol/L FeCl3溶液，產生紅褐色沉淀者初步確認為醋酸菌。

1.3.4 醋酸菌種子活化

斜面保藏的分離菌株接種至GYc中，30 ℃、180 r/min 搖瓶活化24 h。

1.3.5 高產酸醋酸菌的復篩

以AS1.41菌株作為對照。將各活化菌株培養液按10%接種量接種于含體積分數5%乙醇的GYd培養基中，30 ℃、180 r/min搖瓶培養5 d，測定產酸量。

1.3.6 醋酸菌耐受性試驗

1.3.6.1 乙醇耐受性

在乙醇體積分數為1.8%、3.6%、5.4%、7.2%、9%、10%、11%的GYd培養基中分別接入體積分數10%的活化菌液，培養基裝液量均為100 mL/250 mL三角瓶，30 ℃、180 r/min搖瓶培養，每隔24 h測定OD600和產酸量，直至穩定。

1.3.6.2 溫度耐受性

在乙醇體積分數為3.6%的GYd培養基中接入體積分數10%的活化菌液，裝液量同上，180 r/min搖瓶培養，溫度分別設定為26、30、34、37、40、42 ℃，取樣測定同上。

1.3.6.3 乙酸耐受性

在乙醇體積分數為3.6%，乙酸體積分數分別為0、1%、2%、3%、4%、5%的GYd培養基中接入體積分數10%的活化菌液，裝液量、培養條件和取樣測定同1.3.6.1。

1.3.6.4 鹽耐受性

在乙醇體積分數為3.6%，鹽質量濃度分別為0、3.0、6.0、9.0、12.0、14.0、16.0、18.0 g/L的GYd培養基中接入體積分數10%的活化菌液，裝液量、培養條件和取樣測定同1.3.6.3。

1.3.7 菌種鑒定

選擇產酸量和條件耐受性最優的分離菌株進行菌種鑒定。基因組DNA提取按參考文獻操作[14-15]。利用16S rDNA兩端引物和聚合酶鏈反應擴增目的菌株16S rRNA基因[16]，引物序列分別為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACG-ACTT-3′。DNA電泳檢測擴增結果，然后對擴增的16S rRNA基因進行測序。最后將測序結果與GenBank中的已知序列進行同源比對，判定細菌種類，將細菌劃分到屬或種[17]。利用MEGA 5.0軟件采用相鄰法構建系統發育樹[18]。

1.3.8 指標測定方法

菌體生物量用分光光度計測定波長600 nm處的光密度，用OD600值來表示菌體的生物量；產酸量測定參照GB/T 12456—2008食品中總酸的測定指示劑法。

2 結果與分析

2.1 高產酸醋酸菌的篩選與初步鑒定

2.1.1 醋酸菌的初篩

由圖1可知，在富集培養液稀釋度為10-5篩選平板上，有32個單菌落產生了透明圈。從中挑取3個透明圈直徑比明顯較大的單菌落，進行劃線分離，最后從篩選分離平板上挑取單菌落進行斜面保藏，編號分別為JM1、JM2、JM3。

圖1 菌株篩選平板Fig.1 Screening plate of strains

2.1.2 醋酸菌定性

由于固態醋醅中菌相較為復雜，僅從篩選特征和菌落形態難以確認為符合要求的醋酸菌，因此對初篩菌株JM1、JM2、JM3進行革蘭氏染色和產酸定性實驗，結果如表1所示。由表1可知，3個初篩菌株均為G-，均為醋酸產生菌。

表1 醋酸菌初步鑒定結果Table 1 Preliminary identification of acetic acid bacteria

注：-為陰性；+為陽性

2.1.3 高產酸醋酸菌的復篩

將所有試驗菌株分別接種于乙醇體積分數為5%的GYd培養基中培養5 d，產酸結果如圖2所示。JM1、JM2、JM3、AS1.41產酸量分別為37.0、42.0、38.5、26.0 g/L。篩選菌株的產酸量均顯著高于AS1.41(P<0.05)。

圖2 各菌株發酵5 d的產酸量Fig.2 Acid-producing yield of the strains after fermented for 5 days

2.2 醋酸菌條件耐受性

2.2.1 乙醇耐受性

試驗菌株在乙醇體積分數不同的發酵液中生長和產酸情況如圖3所示。所示由圖3可知，乙醇體積分數從1.8%增加至11%的過程中，各醋酸菌生物量均呈現下降趨勢，而產酸量均呈現先增加后降低的趨勢，表明試驗體積分數的乙醇對各醋酸菌的生長均有一定程度的抑制作用，而一定體積分數的乙醇對產醋酸有利。乙醇體積分數為3.6%時，AS1.41產酸量最大，達到30.6 g/L；而JM1、JM2、JM3在乙醇體體積分數為5.4%時產酸量均最大，其中JM2產酸量最高，可達49.8 g/L。在乙醇體積分數為3.6%～7.2%，JM1、JM2、JM3的產酸較強且穩定。當乙醇體積分數增至10%以上時，所有試驗菌株生長和產酸均明顯受抑制，AS1.41甚至停止產酸，這與乙醇抑制細菌生長和代謝的作用有關[19-20]。比較可知，JM2具有相對較好的乙醇耐受性，產酸能力也明顯高于AS1.41。

A-菌體生物量；B-產酸量圖3 乙醇體積分數對菌體生物量和產酸量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on bacterial biomass and acid production

2.2.2 溫度耐受性

溫度耐受性試驗結果如圖4所示。在26～37℃，所有試驗菌株生長和產酸均較穩定，37～40 ℃時，生長和產酸均趨于停滯狀態。JM1、JM2、JM3最適培養和產酸溫度為30 ℃左右，且在26～37 ℃產酸能力均較強，其中JM2的產酸量最高，達38.9 g/L。AS1.41適宜的培養溫度為30～34 ℃，適宜的產酸溫度30～37 ℃，產酸達到32 g/L。在一定的培養溫度范圍內，溫度上升會有利于醋酸菌的生長和代謝，而溫度過高會導致醋酸菌產酶能力降低，因此產酸下降[21]。綜合分析可知，JM2具有更好的溫度耐受性。

A-菌體生物量；B-產酸量圖4 溫度對菌體生物量和產酸量的影響Fig.4 Effect of temperature on bacterial biomass and acid production

2.2.3 乙酸耐受性

試驗菌株的乙酸耐受性結果如圖5所示。乙酸對4株醋酸菌的生長均具有一定抑制作用，而體積分數1%的乙酸似乎可以促進醋酸菌的產酸，使JM1、JM2和AS 1.41的產酸量均達到最高，此時JM2的產酸量最高為40.5 g/L，而AS1.41產酸量為32.7 g/L；當乙酸體積分數增加至4%以上時，醋酸菌的生長和產酸均受到明顯抑制，因為過酸的環境會影響醋酸菌的生長[22]。過酸和堿性的環境都會導致相關酶活性的下降，從而影響醋酸菌的生長和產酸能力[23]。綜合分析，在相同乙酸濃度下，AS1.41的生長情況好于3株分離醋酸菌菌株，而JM2在乙酸為體積分數為0%～2%的條件下，乙酸耐受性最強。

A-菌體生物量；B-產酸量圖5 乙酸體積分數對菌體生物量和產酸量的影響Fig.5 Effect of acetic acid volume fraction on bacterial biomass and acid production

2.2.4 鹽耐受性

由圖6可知，在鹽質量濃度為0～16.0 g/L時，3個篩選菌株表現出較好的耐鹽性，其中JM2耐鹽能力最強。在低于質量濃度為3.0 g/L的鹽溶液中，鹽對JM1、JM2、JM3的生長和產酸均沒有顯著影響，而AS1.41的產酸有明顯降低；當鹽質量濃度從3.0 g/L增至14.0 g/L，AS1.41的生長及產酸量呈現明顯下降的趨勢，并且在質量濃度為14.0 g/L時，幾乎停止產酸；而當鹽質量濃度從3.0 g/L增至12.0 g/L，JM1、JM2、 JM3的生長及產酸量所受影響較小，當鹽質量濃度從12.0 g/L增至18.0 g/L，JM1、JM2、JM3生長和產酸量呈現明顯的下降趨勢，其中JM2產酸量一直高于JM1和JM3。低鹽質量濃度對醋酸菌生長影響較小，但隨著鹽質量濃度的增加，醋酸菌的生長受到嚴重抑制，并且影響其產酸能力[24]。綜合分析，JM2的鹽耐受性最好。

A-菌體生物量；B-產酸量圖6 鹽濃度對菌體生物量和產酸量的影響Fig.6 Effect of salt concentration on bacterial biomass and acid production

對耐受性試驗結果進行綜合分析可知，在各試驗條件下，AS1.41的生長適應能力較強，而JM1、JM2、JM3的產酸能力卻明顯高于AS1.41。以滬釀1.01為對照菌株時，文獻報道也有類似規律發生[25]。最終試驗確定JM2產酸能力最強、條件耐受性最好，需要進一步對JM2進行菌種鑒定。

2.3 目的菌株的16S rDNA測序及系統發育分析

2.3.1 DNA的提取及其PCR擴增

以JM2菌株的DNA為模板，采用特定的引物進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖7所示，基因擴增的產物大小約為1 500 bp，結合參考文獻[26]可知，實驗結果符合預期。

圖7 JM2醋酸菌的16S rDNA擴增電泳圖Fig.7 Electrophoresis pattern of 16S rDNA amplification of acetic acid bacteria JM2

2.3.2 同源序列分析及系統發育樹構建

將JM2菌株的16S rDNA序列放入NCBI數據庫進行比對，結果表明菌株JM2與熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)的16S rDNA序列相似度達到100%，結合文獻[27]可以確認JM2為熱帶醋酸菌。然后采用NJ法構建系統發育樹，結果如圖8所示。

圖8 采用NJ法構建的系統發育進化樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method

由圖8可知，菌種JM2顯示與熱帶醋酸桿菌(AcetobactertropicalisSCMA19)具有最親近的關系。結合16S rDNA序列同源性和系統發育樹分析結果，確定JM2菌株為熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)。

3 結論

陜西民間有釀醋的傳統，有豐富的醋醅資源，因此陜西民間醋醅是優良醋酸菌菌種的寶庫。本研究從新鮮的陜西民間醋醅中篩選到3株醋酸菌JM1、JM2、JM3，與AS1.41進行產酸和條件耐受性比較，發現JM2的條件耐受性和產酸能力相對較強，在其他條件適宜的情況下，可耐受的乙醇體積分數、乙酸體積分數、鹽質量濃度分別為9%、3%和16.0 g/L，在26～37 ℃具有較強而穩定的產酸能力。經16S rDNA基因測序和分析，確定JM2為熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)。JM2是1株高產酸且耐受性較好的醋酸菌，具有很好的工業應用前景。