固定化乳糖酶在低乳糖乳制品中的應(yīng)用

文/景文娟 劉曉蘭

（黑龍江齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院）

牛乳是人們從大自然中獲得的“最完美的天然食物”[1]，然而乳糖不耐癥這一世界性問題已經(jīng)成為制約乳制品消費增長的重要因素[2，3]，中國成人乳糖不耐癥的比例為75.00%～92.00%[3～5]。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，EC 3.2.1.23）能夠水解牛奶中的乳糖，生成D-葡萄糖、D-半乳糖、低聚半乳糖[6]。通過乳糖酶水解技術(shù)，研究、開發(fā)和生產(chǎn)低乳糖含量的乳制品，對解決現(xiàn)階段乳糖不耐癥問題，增加人均乳制品攝入量具有深遠(yuǎn)意義。

經(jīng)調(diào)查，部分乳品企業(yè)通過在牛乳中直接添加乳糖酶的方式生產(chǎn)低乳糖乳制品，該方法存在乳糖酶無法回收，反應(yīng)時間無法控制，乳糖酶用量大、生產(chǎn)成本高等缺點[7，8]，而乳糖酶的固定化有望解決上述問題。固定化酶技術(shù)從1957年發(fā)展至今，已應(yīng)用的固定化載體主要有海藻酸鈉[9～13]、樹脂[14～16]、殼聚糖[17～19]、纖維素[20～22]、磁性高分子微球[23]等。通過殼聚糖將乳糖酶固定化，測定最適反應(yīng)條件、穩(wěn)定性及重復(fù)利用次數(shù)；通過響應(yīng)面法優(yōu)化總結(jié)制備低乳糖乳制品的最適水解條件；通過對添加輔料的低乳糖乳制品進(jìn)行感官評價，解決牛乳脫乳糖后的口感問題。進(jìn)而為規(guī)模化生產(chǎn)受大眾歡迎、口感佳、營養(yǎng)豐富的低乳糖乳制品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

生鮮乳由黑龍江省光明松鶴乳品有限責(zé)任公司提供；β-半乳糖苷酶為Sigma產(chǎn)品；殼聚糖為上海生工生物有限公司；鄰硝基苯-β-D吡喃半乳糖（ONPG）為上海寶曼生物科技股份有限公司產(chǎn)品；戊二醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和無水碳酸鈉為天津科密歐試劑公司產(chǎn)品；其他試劑均為市售分析純試劑。

1.2 主要設(shè)備

水浴恒溫振蕩器（SHZ-82）為江蘇金怡儀器科技有限公司產(chǎn)品；酸度計（FE20）為梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀（HPLC 1260）、紫外分光光度計（Cary 50）為美國安捷倫公司產(chǎn)品；干燥箱（DHP-9272）為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

表1 RSA水解乳糖試驗因素與水平表

1.3 試驗方法

1.3.1 乳糖酶的固定化

用注射器將2.00%乙酸配制的殼聚糖溶液1∶20（m/V）滴入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液中，殼聚糖凝聚成白色微球后靜置1 h，過濾殼聚糖微球，用蒸餾水洗滌至中性，加入到2.00%的戊二醛溶液中，在30.00℃下恒溫水浴搖床搖動交聯(lián)3 h，用蒸餾水洗去多余的戊二醛。

稱取2.5 g殼聚糖微球，加入到10.0 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.5）中，添加15 mg β-半乳糖苷酶，10.00 ℃下180 r/min震蕩吸附16 h。濾出微球，用蒸餾水洗至中性，置于0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，4.00℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 固定化乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性試驗

（1）乳糖酶活力的測定

參照文獻(xiàn)[24，25]報道的方法測定，取0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.5） 1.8 mL，加入0.1 mL濃度為0.02 mol/L的鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG），分別0.1 g固定化乳糖酶和0.1 mL游離乳糖酶，50.00 ℃水浴10.00 min，加入2.0 mL濃度為1.0 mol/L碳酸鈉溶液使反應(yīng)終止，在400 nm處測定溶液的光密度（Optical Delnsity，OD），計算酶活力。

（2）固定化乳糖酶酶最適反應(yīng)溫度的測定

按照酶活力的測定方法，分別在20.00～90.00 ℃條件下反應(yīng)，以最適溫度下測得的游離乳糖酶活為100.00%，測定不同反應(yīng)溫度下固定化乳糖酶相對酶活力。

（3）固定化乳糖酶最適反應(yīng)pH值的測定

按照酶活力的測定方法，分別在pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的系列緩沖溶液中反應(yīng)，以最適pH值下測得的游離乳糖酶活為100.00%，測定相對酶活力。

（4）金屬離子對固定化乳糖酶活性的影響

在pH值為6.5、溫度50.00 ℃條件下，用磷酸鹽緩沖液配制1.0 mmol/L的MgCl2、KCl、CaCl2、FeCl2、ZnCl2、CuCl2溶液代替磷酸鹽緩沖溶液，測定不同金屬離子作用下固定化乳糖酶活力，以磷酸鹽緩沖溶液作為對照，比較相對酶活力。

（5）固定化乳糖酶機(jī)械操作穩(wěn)定性及重復(fù)利用次數(shù)

隨機(jī)選取大小均勻、顆粒飽滿且完整的凝膠球狀固定化乳糖酶，按1.00 g/L的添加量加入到pH值約為6.7的生鮮乳中，置于50.00 ℃搖床中200 r/min振蕩，每隔3 h將固定化乳糖酶與生鮮乳分離，用蒸餾水沖洗，觀察固定化酶凝膠顆粒狀態(tài)有無破裂。分離出的生鮮乳及時進(jìn)行沸水浴滅酶10.00 min，用高效液相色譜（HPLC）法測定樣品中乳糖含量，計算乳糖水解率。連續(xù)重復(fù)測定10 次，乳糖水解率大于70.00%的重復(fù)次數(shù)，即為固定化乳糖酶的重復(fù)利用次數(shù)。

1.3.3 低乳糖乳制品水解條件響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法（RSA）進(jìn)行試驗設(shè)計，以水解溫度、水解時間、固定化乳糖酶的加酶量為因素，以乳糖水解率為響應(yīng)值，確定酶解的最佳工藝參數(shù)，見表1。

采用HPLC法測定生鮮乳樣品中乳糖含量，乳糖水解率計算見公式1。

公式1中，S為乳糖水解率；X1為樣品水解前乳糖含量；X2為樣品水解后乳糖含量。

1.3.4 低乳糖乳制品配方的確定

椰粉中富含中碳鏈脂肪酸甘油三酯（MCT），能迅速被人體吸收并快速氧化產(chǎn)生能量；瑪卡粉具有提神醒腦、消除疲勞、促進(jìn)新陳代謝的作用[26]。通過調(diào)整椰粉、瑪卡粉、乳清蛋白粉、果葡糖漿的比例來改善低乳糖乳制品的口感，由10 位經(jīng)過感官評鑒培訓(xùn)的人員對樣品分別進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評價評分標(biāo)準(zhǔn)

2.1 溫度對固定化乳糖酶活力的影響

酶是一種蛋白質(zhì)，溫度對酶活性影響較大，溫度過高時，酶蛋白變性失活；酶的最適反應(yīng)溫度是酶穩(wěn)定性與反應(yīng)速率的綜合結(jié)果，提高反應(yīng)速度，節(jié)省反應(yīng)時間，可避免生鮮乳因長時間水解而變質(zhì)。游離乳糖酶與固定化乳糖酶的最適反應(yīng)溫度如圖1所示。

試驗結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)溫度的增加，相對酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。游離乳糖酶的最適反應(yīng)溫度為40.00 ℃，乳糖酶固定化后在50.00～70.00 ℃活性穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度較游離酶有所升高，這是由于殼聚糖能夠提供更好的保護(hù)作用，提高了酶的熱穩(wěn)定性，固定化載體使其在更高的溫度下仍能具有較高的酶活力。

圖1 溫度對固定化乳糖酶活力的影響

2 結(jié)果與討論

2.2 pH值對固定化乳糖酶活力的影響

酶的催化能力對外部環(huán)境非常敏感，在強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性條件下會導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活變性。在制備低乳糖乳制品過程中，由于生鮮乳pH值約為6.7，因此，研究固定化乳糖酶在此pH值范圍內(nèi)的穩(wěn)定性尤為重要。游離乳糖酶及固定化乳糖酶的最適pH值如圖2所示。

試驗結(jié)果顯示，游離乳糖酶和固定化乳糖酶的活力趨勢基本一致，游離酶最適反應(yīng)pH值為5.0，固定化乳糖酶在pH值為4.5時活力最高，這是因為當(dāng)酶被結(jié)合到多聚陽離子載體上時，載體上帶正電荷的基團(tuán)使載體表面H+濃度比外部溶液中H+濃度低，pH值高于外部溶液，使外部溶液中的pH值向酸性偏移。固定化酶在pH值為6.7左右時，仍保持80.00%以上酶活力。由此可看出，乳糖酶經(jīng)固定化后在生鮮乳pH值范圍內(nèi)活力穩(wěn)定，適用于低乳糖乳制品的制備。

2.3 金屬離子對固定化乳糖酶活力的影響

生鮮乳中含有較多的鈣、鐵、鋅、鎂等金屬離子，這些金屬離子會對固定化乳糖酶的活力產(chǎn)生影響。試驗中，選用MgCl2、CaCl2、KCl等溶液代替磷酸鹽緩沖液，測定不同金屬離子作用下固定化乳糖酶的活力，與磷酸鹽溶液進(jìn)行比較，相對酶活力如圖3所示。

由圖3可以看出，M g2+、Fe2+、Zn2+對固定化乳糖酶激活作用明顯；Ca2+、K+對固定化乳糖酶活性影響作用不大；Cu2+對固定化乳糖酶活力起抑制作用，可能由于Cu2+與酶蛋白側(cè)鏈殘基結(jié)合而導(dǎo)致酶失活。生鮮乳中Cu2+的含量僅為0.02 mg/100 g，對固定化酶的抑制作用可忽略不計。

圖2 pH值對固定化乳糖酶活力的影響

圖3 金屬離子對固定化乳糖酶活性的影響

表3 固定化乳糖酶機(jī)械操作穩(wěn)定性

2.4 固定化乳糖酶的穩(wěn)定性

用固定化乳糖酶經(jīng)過10 次反復(fù)試驗制備低乳糖乳制品，每次試驗結(jié)束后及時觀察凝膠顆粒形態(tài)，測定乳糖水解率，固定化酶重復(fù)利用次數(shù)與乳糖水解率的關(guān)系見表3。

隨著重復(fù)利用數(shù)的增加，凝膠顆粒無破碎開裂現(xiàn)象，乳糖水解率逐漸下降；當(dāng)利用固定化乳糖酶酶解試驗重復(fù)9 次后，乳糖水解率下降到70.00%以下，從而得出固定化乳糖酶重復(fù)利用次數(shù)為8 次。提高固定化酶的重復(fù)利用次數(shù)，有利于節(jié)約成本。

2.5 低乳糖乳制品水解條件的優(yōu)化

表4 RSA試驗結(jié)果

圖4 各因素對乳糖水解率的響應(yīng)面圖

乳糖水解率是衡量乳糖水解程度的重要指標(biāo)，采用HPLC法對乳糖含量進(jìn)行測定。以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、固定化的酶添加量為因素，乳糖水解率為響應(yīng)值，進(jìn)行低乳糖乳制品條件試驗，RSA試驗結(jié)果見表4。

通過Design Expert.V8.0.6.1軟件得到：水解率=79.50+7.74A+1.91B+9.55C+0.75 AB+2.44AC+0.035BC-9.67A2-17.12B2-9.35C2。對該模型進(jìn)行回歸方差分析，見表5。

由表5可知，模型是顯著，失擬項不顯著，且R2是0.9940，是0.9864，該模型與試驗結(jié)果良好擬合。通過響應(yīng)面曲線圖（圖4）可進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用并確定最優(yōu)點。

由圖4（a）可見，當(dāng)固定化乳糖酶的添加量為1.00 g/L時，相同溫度，乳糖水解率隨時間的延長而增加；相同水解時間，水解率隨著溫度的增加呈拋物線變化。當(dāng)固定化乳糖酶的添加量為1.00 g/L，水解溫度為50.32 ℃，水解時間為191.54 min時，乳糖水解率最高可達(dá)80.99%。

圖4（b）表明，水解溫度為50.00 ℃時，水解時間相同，乳糖水解率隨固定化乳糖酶的添加量增加而增加；酶的添加量一致時，水解時間與乳糖水解率呈正相關(guān)。當(dāng)加酶量為1.28 g/L，水解時間為193.62 min時，乳糖水解率最高可達(dá)83.90%。

圖4（c）表明，水解時間為180.00 min的條件下，水解溫度一定，隨著加酶量的增加，乳糖水解率隨之增加；同一加酶量，乳糖水解率與反應(yīng)溫度呈拋物線趨勢，由于溫度過高，導(dǎo)致酶的相對失活。當(dāng)反應(yīng)溫度為50.28 ℃，固定化酶添加量為1.28 g/L時，乳糖水解率預(yù)測值為81.99 %。

通過軟件對試驗得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，得出制備低乳糖牛奶的最佳水解條件：反應(yīng)溫度50.33 ℃，反應(yīng)時間181.99 min，加酶量1.28 g/L，軟件估測乳糖水解率最高為83.98%。按該組合進(jìn)行3 次驗證試驗，制得的低乳糖乳制品水解率均值為（82.79±1.31）%，與軟件估測結(jié)果能良好吻合。

表5 回歸方程方差分析

表6 L9（34）低乳糖牛奶飲品配方正交試驗因素水平

2.6 低乳糖乳制品添加劑配方的確定

以瑪卡粉、椰粉、乳清蛋白粉、果葡糖漿4種原料，設(shè)計L9（34）正交試驗，通過感官評價得分的方式，確定產(chǎn)品的最佳配方見表6。

通過10 位感官評鑒人員對產(chǎn)品色澤、組織狀態(tài)、氣味和口感分別進(jìn)行評分，分?jǐn)?shù)總和為總得分，平均值的整數(shù)為該產(chǎn)品得分，感官評分結(jié)果見表7。

由表7中的極差值可以看出，4 個因子對感官評價結(jié)果的影響作用由大到小依次為瑪卡粉、乳清蛋白粉、椰粉、果葡糖漿。在試驗水平范圍內(nèi)，打分最高的組合是A2B2C3D1，即最佳添加劑配方為：瑪卡粉0.08%、椰粉3.00%、乳清蛋白粉1.80%和果葡糖漿2.00%。通過3 次平行驗證試驗，平均值為88 分，配制的低乳糖乳制品呈淡黃色，甜度適宜，具有椰子清香味，爽滑適口，因此選擇A2B2C3D1配料組合為最佳配方。

表7 低乳糖牛奶飲品配方正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

殼聚糖固定化的乳糖酶在50.00～70.00 ℃活性穩(wěn)定，酶的最適反應(yīng)溫度較游離酶有所升高；在生鮮乳固有pH值范圍內(nèi)保持80.00%以上酶活力。制備低乳糖乳制品的最佳反應(yīng)條件為50.33 ℃、181.99 min、固定化乳糖酶添加量1.28 g/L，該條件下制備的低乳糖乳制品，乳糖水解率為83.98%。水解乳糖過程中微球顆粒無破損現(xiàn)象，穩(wěn)定性好，可重復(fù)使用8 次，極大的提高了酶的利用率，降低了生產(chǎn)成本和管理費用。通過調(diào)節(jié)瑪卡粉、椰粉、乳清蛋白粉、果葡糖漿的配比，制備出了氣味清香，甜度適宜、營養(yǎng)豐富、受消費者歡迎的低乳糖乳制品。為固定化酶工業(yè)化生產(chǎn)低乳糖乳制品奠定基礎(chǔ)。C