連續(xù)性腎臟替代治療對膿毒癥患者外周血部分T淋巴細胞、miRNA-155和miRNA-466表達的影響*

鄭燕玲，張應魏，鄧小彥

(1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，海南 海口 570000； 2.海南省老年病醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，海南 海口 571100)

膿毒癥是因感染誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征，膿毒癥發(fā)生過程中機體的先天性免疫系統(tǒng)被激活，使患者機體發(fā)生強烈的免疫應答[1]；有研究表明，在疾病持續(xù)發(fā)展過程中機體的免疫功能會發(fā)生異常，因固有免疫細胞過度活化而出現(xiàn)炎癥反應與細胞免疫功能紊亂及損害[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為內(nèi)源性基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，是直接由核苷酸酶DiceR剪切加工而成，其長度為21～23個核苷酸[3]。研究顯示，miRNA與多種疾病發(fā)生、生理及病理過程密切相關(guān)，機體處于免疫功能異常或高炎癥刺激時miRNA表達會出現(xiàn)異常[4]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155、minRNA-466在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，可在一定程度中反映機體炎癥情況與免疫功能[5]。連續(xù)性腎臟替代治療(continuous renal repalccment therapy，CRRT)經(jīng)過連續(xù)清除患者血液中的毒素、中小分子物質(zhì)及致病介質(zhì)來保障機體內(nèi)環(huán)境的平衡，對膿毒癥患者的炎癥反應與機體免疫應答具有調(diào)節(jié)作用，但目前CRRT對膿毒癥患者外周血microRNA-155、microRNA-466表達的影響未見報道。本研究對42例膿毒癥患者進行CRRT治療，觀察治療后患者外周血miRNA-155、minRNA-466的表達變化，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月-2019年2月收治的膿毒癥患者80例，采用隨機數(shù)字表法分為觀察組(42例)與對照組(38例)。所有入選患者符合《2001年國際膿毒癥定義會議關(guān)于膿毒癥診斷的新標準》[6]中膿毒癥診斷標準，年齡65～74歲；排除既往進行過腎移植手術(shù)者、確診為終末期腎臟疾病者，排除已明確或疑似腎臟性疾病及低血容量性休克患者。觀察組男28例、女14例，平均(72.32±2.21)歲，急性生理與慢性健康(acute physiology and chronic healthevaluation，APACHE Ⅱ)評分(22.17±7.20)分，全身性感染相關(guān)性器官功能衰竭評分(sequential organ failure assessment，SOFA)評分(10.52±2.75)分；對照組男26例、女12例，平均年齡(72.18±2.19)歲，APACHE Ⅱ評分(22.35±8.18)分，SOFA評分(10.21±2.62)分，2組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；本研究所有入選患者均為自愿參與，且簽署知情同意書；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

對照組患者根據(jù)國際膿毒癥和膿毒癥休克指南，采用對癥、抗炎、抑菌及補液等治療，4周為1個療程；觀察組患者在對照組治療的基礎(chǔ)上加用CRRT治療，以連續(xù)性靜脈-靜脈血液濾過模式，患者血流量保持100～160 mL/min，具體的CRRT清除率與超濾量按照個體現(xiàn)狀來確定，治療持續(xù)48 h，2次/周(間隔時間至少24 h)，4 周為1個療程。

1.3 觀察指標

比較2組患者治療前及治療4周時的APACHE Ⅱ評分、SOFA評分、外周血免疫指標[CD4+、CD8+、CD14+單核細胞人類白細胞抗原DR(monocyte human leukocyte antigen，DRHLA-DR)]、炎癥因子 [降鈣素原(PCT)、白細胞介素-23(IL-23)、C-反應蛋白(CRP)]、miRNA-155及miRNA-466水平。(1)APACHE Ⅱ評分[7]及SOFA評分[8]：APACHE Ⅱ評分總分為71分，得分越高則提示患者不良預后越嚴重； SOFA評分總共評估6個系統(tǒng)，評分為0～4分，取得的分數(shù)越高則其器官損傷及不良預后越嚴重。(2)治療前及治療4周時抽取患者外周靜脈血5 mL，采用流式細胞儀(型號FACScan，賽默飛世爾科技)檢測CD4+、CD8+、DRHLA-DR，免疫發(fā)光夾心法檢測PCT含量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-23含量，，酶速率散射比濁法檢測CRP含量。(3)采用TRIzol一步法提取總RNA，操作步驟根據(jù)美國Invitrogen公司TRIzol試劑盒說明，總RNA的吸光度值采用紫外分光光度計(型號UV-5200，上海儀電分析儀器有限公司)測定，引物為上海生工生物工程股份有限公司合成，反應總體積25 μL，反應條件為95 ℃預變性 15 min，95 ℃ 15 s、70 ℃ 90 s、60 ℃ 60 s，共35個循環(huán)，miRNA-155及miRNA-466相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 APACHE ⅡI及SOFA評分

治療前，2組患者APACHE Ⅱ、SOFA評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，2組患者APACHE Ⅱ、SOFA評分較治療前顯著降低(P<0.05)，觀察組患者APACHE Ⅱ、SOFA評分低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者治療前及治療4周時APACHE Ⅱ及SOFA評分Tab.1 Comparison of APACHE Ⅱ and SOFA scores before and after treatment in both groups

注：(1)與同組治療前比較，P<0.05;(2)與對照組治療4周時比較，P<0.05。

2.2 外周血免疫學指標

治療前，2組患者CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、DRHLA-DR百分比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，2組患者CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、DRHLA-DR百分比較治療前顯著升高(P<0.05)，觀察組患者CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、DRHLA-DR百分比顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前及治療4周時部分外周血免疫學指標/%Tab.2 Comparison of peripheral blood immune indexes before and after treatment in both groups/%

注：(1)與同組治療前比較，P<0.05;(2)與對照組治療4周時比較，P<0.05。

2.3 炎癥因子

兩組患者治療前及治療4周時結(jié)果比較，治療前，2組患者血清PCT、IL-23及CRP水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，2組患者血清PCT、IL-23及CRP水平較治療前顯著降低(P<0.05)，觀察組患者血清PCT、IL-23及CRP水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前及治療4周時部分炎癥因子水平/(ng/L)Tab.3 Comparison of inflammatory factors levels before and after treatment in both groups/(ng/L)

注：(1)與同組治療前比較，P<0.05;(2)與對照組治療4周時比較，P<0.05。

2.4 miRNA-155及miRNA-466表達水平

治療前，2組患者外周血miRNA-155、miRNA-466表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，2組患者外周血miRNA-155、miRNA-466表達水平較治療前顯著降低(P<0.05)，觀察組患者外周血miRNA-155、miRNA-466表達水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者治療前及治療4周時外周血miRNA-155及miRNA-466表達水平Tab.4 Comparison of miRNA-155 and miRNA-466 expression before and after treatment in both groups

注：(1)與同組治療前比較，P<0.05;(2)與對照組治療4周時的比較，P<0.05。

3 討論

CRRT可清除膿毒癥患者中小分子溶質(zhì)、與膿毒癥相關(guān)的炎癥因子、調(diào)節(jié)電解質(zhì)與酸堿平衡紊亂，同時可在穩(wěn)定血流動力學基礎(chǔ)中作用于免疫應答失衡，降低對臟器的損傷，保證內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性[9-10]。有研究報道，膿毒癥患者無論是否發(fā)生急性腎功能損傷，皆可在集束化治療基礎(chǔ)中聯(lián)合CRRT治療[11]。

APACHE Ⅱ、SOFA評分作為目前國際中應用于危重學科的評分系統(tǒng)，其評分結(jié)果與疾病嚴重程度密切相關(guān)，尤其在膿毒癥患者的病情分類與預后判斷中廣泛應用[12]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，治療后2組APACHE Ⅱ、SOFA評分較治療前顯著下降；且觀察組APACHE Ⅱ、SOFA評分下降更顯著，提示治療后患者病情得到改善。有研究報道，膿毒癥患者機體常因CD8+T細胞調(diào)控細胞內(nèi)病原體的“繼發(fā)性”高度敏感。在外源性導致的敏感源中，CD8+T細胞經(jīng)特異性識別經(jīng)MHC I類分子提呈的內(nèi)源性抗原肽，從而清除病原體感染細胞或腫瘤細胞，在感染與腫瘤免疫中至關(guān)重要[13]。此外，CD14+單核細胞HLA-DR的表達、CD4+T等均參與了膿毒癥患者免疫功能的調(diào)控，DRHLA-DR作為單核巨噬細胞表層中分泌的抗原，是構(gòu)成單核巨噬細胞提成外來抗原的首要分析，HLA-DR可把單核巨噬細胞吞噬同時將抗原傳遞到CD4+、CD8+T輔助細胞，從而活化T細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫細胞，所以HLA-DR水平對免疫功能具有重要作用[14]。膿毒癥患者的CD4+、CD8+T淋巴細胞、患者的機體免疫狀態(tài)較差，CD4+、CD8+T淋巴細胞的變化基本可以反應膿毒癥患者的細胞免疫狀況，本研究中，治療后2組患者CD4+、CD8+T淋巴細胞、DRHLA-DR百分比較治療前升高，觀察組升高更顯著，提示在采用CRRT治療后患者CD4+、CD8+T淋巴細胞有不同程度的恢復，CRRT對機體免疫機能具有調(diào)節(jié)作用，上調(diào)血清T淋巴細胞亞群水平，提高患者免疫功能。

研究發(fā)現(xiàn)，免疫功能失調(diào)會使機體出現(xiàn)炎癥反應與細胞免疫功能紊亂及損害，細胞因子PCT、IL-23及CRP水平會由于機體免疫功能的下降而升高[15-18]。PCT是降鈣素的前體，在機體發(fā)生感染時，PCT呈現(xiàn)高表達，同時在內(nèi)毒素刺激3～4 h，PCT水平會在8～24 h達到高峰，是目前臨床應用評估重癥患者感染的標志物，可有效監(jiān)測膿毒癥變化。IL-23作為異源性二聚體蛋白，具有多元化的生物學作用，能夠分化成熟的T淋巴細胞加快其分泌，在膿毒癥患者IL-23水平顯著高于健康者[19]。CRP主要來源于肝臟分泌合成，在機體受嚴重侵損與感染時呈現(xiàn)為高表達，尤其在炎癥應答4～6 h內(nèi)，CRP短時間中呈現(xiàn)為高表達且在36～50 h內(nèi)水平達到臨界值[20]，有研究表明，膿毒癥患者血清CRP水平與健康群體比較顯著較高[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者治療前PCT、IL-23及CRP水平呈現(xiàn)高表達，在治療后顯著降低，且采用CRRT治療的觀察組下降更顯著，進一步提示CRRT治療可顯著抑制膿毒癥患者炎癥因子表達水平來阻止病情進一步惡化。miRNA在機體處于高炎癥狀態(tài)與低免疫功能時表達情況異常[22]。近年來關(guān)于膿毒癥相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155是感染患者炎癥網(wǎng)絡效應的平衡點，全程參與病理生理階段，可作為評估疾病發(fā)展的特異性指標[23]。mircroRNA-466同樣作為參與感染患者病情發(fā)展的分子標志物，廣泛分布于組織與體液中，在感染患者中miRNA-466異常表達，mircroRNA-466還可能與急性反應相關(guān)，同時參與轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-KBI的調(diào)控，可能由于其可加快脂質(zhì)介質(zhì)蛋白表達，而凋亡的中性粒細胞可在脂質(zhì)介質(zhì)蛋白作用于被巨噬細胞攝取來達到降低炎癥反應的作用[24]。此外，還有研究學說認為miRNA-466作用于PIK3、MAPK傳導信號激活通路，引起細胞因子風暴進一步導致膿毒癥患者發(fā)生感染性休克與多器官衰竭[25]。本研究結(jié)果顯示治療前miRNA-155、miRNA-466受高CD4+、CD8+T淋巴細胞、DRHLA-DR免疫水平與高PCT、IL-23、CRP等炎癥因子水平的影響而升高，在CRRT治療后機體免疫水平與炎癥因子下調(diào)，而miRNA-155、miRNA-466表達下降，提示CRRT治療可影響膿毒癥患者外周血miRNA-155、miRNA-466的表達。

綜上所述，CRRT可調(diào)控CD4+、CD14+HLA-DR、CD8+水平，減輕PCT、IL-23、CRP炎癥因子與miRNA-155和miRNA-155表達。但由于本研究為小樣本研究，需進一步擴大樣本的多中心研究中驗證，以獲得更準確的結(jié)果。