克氏原螯蝦螺原體病原的發現及診斷研究

童心雨

摘? 要：作為一種原核微生物，螺原體個體微小、形態多為螺旋狀且不含細胞壁，大多存在于植物、昆蟲中。近些年發現一種新型螺原體，會造成中華絨螯蟹的“顫抖病”，且對其他水生甲殼動物都表現出廣泛的侵染性，如克氏原螯蝦。于此，尋找一種反應靈敏的定量方法防治中華絨螯蟹“顫抖病”成為當前的研究熱點。明確螺原體在克氏原螯蝦體內的增殖規律，能夠完善水生甲殼動物螺原體疾病的監管，也將有助于其他淡水甲殼類動物螺原體流行病學的研究。

關鍵詞：克氏原螯蝦;螺原體;增殖規律

中圖分類號：S945.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2020）17-0083-02

Abstract： As a prokaryotic microorganism， spiroplasma is small， spiral in shape and does not contain cell wall， and mostly exists in plants and insects. In recent years， a new type of spiroplasma has been found， which can cause "trembling disease" of Chinese mitten crab and show extensive infection to other aquatic crustaceans， such as Procambarus clarkii. Therefore， to find a sensitive quantitative method to control tremor disease of Eriocheir sinensis has become the current research focus. Understanding the proliferation rule of spiroplasma in Procambarus clarkii can improve the supervision of spiroplasma diseases in aquatic crustaceans and will also contribute to the epidemiological study of spiroplasma in other freshwater crustaceans.

Keywords： procambarus clarkii; spiroplasma; proliferation rule

1 克氏原螯蝦的發展現狀

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱小龍蝦，在分類上隸屬于節肢動物門（Arthropoda），甲殼綱（Crustacea），十足目（Decapoda），螯蝦科（Cambaridae），原螯蝦屬（Procambarus）。原產于墨西哥東北部和北美中南部[1]，后由日本引進，20世紀30年代正式傳入我國。作為一個抗逆性極強的水生物種，自然環境下，克氏原螯蝦能夠適應10℃乃至30℃的溫度條件，甚至可以忍受零下或高溫;它們通常棲息于淡水水域之中，也能適應微鹽水域。正是由于這種極強的生命力、寬泛的適應力和旺盛的繁殖力，克氏原螯蝦在世界各地擴散，而且一旦被引入，便會成為當地生態環境里的競爭優勢種群。

極高的經濟價值同樣促使克氏原螯蝦擴散。由于其體型大過許多淡水蝦類，肉質也較為肥美，克氏原螯蝦占據著世界性淡水經濟蝦類的巨頭地位。同時，它作為一種水產經濟資源物，經濟效益極高、產業化前景矚目且發展迅速，近些年來，在國內掀起了養殖熱潮，大量分布在我國江蘇、安徽、湖北等長江中下游地區[2]，已成為最有潛力、最具特色的水產養殖品種之一。

不可忽視的是，克氏原螯蝦的雜食性和資源競爭等機制正嚴重威脅著引入地的生物多樣性。我國需要合理控制小龍蝦的生產量，開展相關生態危害調查研究，避免其成為危險入侵物種。

2 螺原體的研究近況

作為一類特殊微生物，螺原體（Spiroplasma）個體極小、不含細胞壁、形態多變（尤其在指數生長期呈典型的螺旋絲狀）且具有運動性，它能通過220nm的微孔濾膜，是能在人工培養基中培養的最小的單細胞原核微生物。

2.1 螺原體的分類

螺原體在分類上隸屬柔膜體綱（Mollicutes）、蟲原體目（Entomoplasmatales）、螺原體科（Spiroplasmataceae）、螺原體屬（Spiroplasma）。直到上世紀70年代，人們發現它是引起植物、昆蟲某些病害的禍首，但保守的以為螺原體只寄生在植物、昆蟲兩大類之中。之后，科學家們陸續從水生甲殼類動物體內也分離得到螺原體類微生物。在植物中，螺原體會引起玉米矮縮病（corn stunt）等病癥，在蜜蜂體內可導致爬蜂病、五月病等，在水生甲殼動物體內則會引起蝦蟹的“顫抖病”（tremor disease）。可見，大多數螺原體表現出嚴重的致病性，對各種養殖業均造成惡劣影響。

國際原核生物分類委員會在2004年曾提出螺原體多相分類（polyphasic taxonomy）的概念，通過表型（形態特征、生理學特征，生物化學特性）、基因型（GC含量、rDNA序列同源性、指紋圖譜分析等）及系統發生學等信息，確定分離物和已鑒定菌株之間的關系，達到區分親緣關系較近菌株的目的。螺原體依據血清學特性被分為43個血清組，其中包含15個血清亞組，共確立了50個以上的螺原體物種。然而，目前以血清學分析為基礎的螺原體分類仍存在一些爭議。

自從蝦蟹螺原體被發現，其分布范圍以及宿主范圍便由陸地擴大到了水域。同時，螺原體對水生甲殼動物表現出的侵染性也引起了大家的關注。

2.2 螺原體生物學特性

（1）螺原體在形態結構上，沒有細胞壁，呈螺旋形態。缺少細胞壁是螺原體區別于其他原核生物最重要的一點，而其獨特的三明治狀單位膜，使其具有螺旋形、可濾過性、可塑性甚至對某些干擾細胞壁形成的抗生素類藥物產生天然抵抗性。這些獨特性都使螺原體成為當前生物學研究的熱點。

（2）在基因組組成上，螺原體的基因組是環狀雙鏈

DNA，但比絕大多數的原核生物要小;且堿基組成GC含量很低。通常作為終止密碼子的UGA在螺原體中編碼色氨酸，因此只有通過突變才能正常表達出目的蛋白。

（3）在代謝水平上，因為相對較小的基因組，螺原體只能編碼出較少的蛋白質，同時缺少能量代謝中必須的眾多基因，無論是合成生物方面還是代謝水平，自然十分低緩。故螺原體難以適應復雜環境，倘若實驗室要純培養螺原體，配置的培養基應加入固醇類營養物質。

3 蝦蟹內螺原體的診斷方法

3.1 光鏡快速診斷法

光鏡快速診斷法針對螺原體進入血淋巴細胞后形成包涵體的特性，無需染色，直接觀察血涂片便可快速準確找到受病原體感染的血細胞。這種簡易快速的蝦蟹活體血淋巴光鏡檢測方法，只需抽取微量血液即可實時監測健康和感染的蝦蟹活體。光鏡法也為之后的分子生物學和免疫學等其他方法奠定了檢驗基礎。

3.2 分子生物學檢測法

采用Chelex-100試劑對底泥進行提取，將純培養的病原菌和待檢測組織中的模板DNA（寄主肌肉、內臟組織、血液等）分離，該方法甚至能檢測出底泥里的微量病原菌。將實驗室培養的病原菌分離稀釋成特定的不同濃度梯度，使用同種方法擴增后再次檢測，通過比較檢測樣品和已知濃度的純培養物PCR產物條帶亮度，運用軟件將條帶明暗差異轉換成數字差異，能夠分析出樣品中螺原體的濃度相對含量。該方法較之常規PCR手段，既靈敏快速又簡單廉價，能夠大批量檢測蝦蟹螺原體感染，進一步判斷患病蝦蟹的受感染程度。

3.3 螺原體的微生物學培養及電鏡檢測法

由于螺原體能夠生長在M1D或R2特殊培養基中，碾壓磨碎患病蝦蟹組織后，濾過220nm的微孔濾膜，再接種到含有酚紅的培養基中，3到5天后后若培養基從粉紅色變為橘黃色，則表明這些患病蝦蟹體內存在螺原體病原。電鏡負染觀察培養基中的培養物，能夠找到螺原體呈典型螺旋結構，從而準確診斷螺原體病原。

3.4 ELISA檢測法及快速診斷試劑盒法

螺原體侵染蝦蟹體內血淋巴后即擴散，此時采集微量血淋巴，通過傳統間接ELISA方法進行有效檢測。一種新型ELISA檢測試劑盒靈敏度達0.573μg/mL，無論批內變異系數還是批間變異系數均低于10%，因此具備良好的穩定性。2到3小時內即可有效測出侵染“顫抖病”蝦蟹體內的病原，提前診斷出螺原體的侵染情況。

4 克氏原螯蝦體內的螺原體病原監測

由于螺原體疾病的爆發，小龍蝦產業遭受了巨大的經濟損失。以往認知中，螺原體疾病普遍存在于植物和昆蟲之中，2004年首次發現它也是中華絨螯蟹“顫抖病”的病原體。除此之外，這種病原體在克氏原螯蝦、羅氏蝦和海水南美白對蝦等其他甲殼類水生生物體內也表現出明顯的擴散性。從患病小龍蝦體內分離出不同的螺原體，染色后發現與其他淡水甲殼綱動物（蟹螺原體、草蝦螺原體）體內的螺原體是相同的物種，從此被正式命名為Spiroplasma eriocheiri。診斷法和流行病學調查法在螺原體疾病的控制中發揮著關鍵作用，如何高效的控制住螺原體疾病已經成為世界范圍內實現甲殼綱動物可持續生產的重中之重。

目前在甲殼綱動物螺原體的監控、檢測和診斷方面主要有臨床癥狀法、直射光顯微鏡法、組織病理學、原位雜交和常規PCR技術。然而，這些所有的實驗方法都沒有辦法量化受感染組織的病原體。如何測定出病原體的增殖已然是甲殼動物疾病監控中最重要的一個環節，特別是在無病癥個體的病原體檢測方面，以便特定的無病原部分的生長，并做到小龍蝦兩地運輸的監控。實時熒光定量PCR技術被廣泛運用，其中最常用的兩種檢測方法是Taqman探針法和SYBR Green染色法。越來越多的研究人員偏向使用更簡單廉價的SYBR Green染色法來進行實時PCR研究。

5 結束語

小龍蝦作為我國水產養殖經濟巨頭，近幾年來遭受著螺原體“顫抖病”的威脅，不僅在經濟上形成了嚴重損失，也阻礙了以克氏原螯蝦為代表的的水生甲殼類動物的可持續生產。因此迫切需要控制住該類螺原體疾病。在全球范圍內，通過積極開展該病原在生物學特性及致病機理方面的研究，建立一個能夠快速診斷并進行實時監測的綜合防治技術，也將有助于進一步在其他淡水甲殼類動物中進行螺原體流行病學的研究。

參考文獻：

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