降糖增效方對糖尿病大鼠肝臟胰島素信號通路IRS1位點磷酸化的影響

許光遠 張曉明

〔摘要〕 目的 通過觀察降糖增效方對糖尿病大鼠肝臟胰島素受體底物1（insulin receptor substrates 1，IRS1）磷酸化的影響來探討該方發揮降糖增效作用的機制。方法 將40只6～8周齡雄性ZDF（fa/fa）大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組（0.134 g/kg）、降糖增效方組（0.64 g/kg）、聯合組（降糖增效方0.64 g/kg+二甲雙胍0.134 g/kg），另選ZDF（fa/+）大鼠10只為正常組，連續干預6周;實驗結束檢測體空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、血清胰島素水平（fasting insulin，FINS）、胰島素抵抗指數（homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）;蛋白免疫印跡法（Western bloting）檢測IRS1絲氨酸磷酸化位點ser307、ser612、ser1101表達。結果 與模型組相比較，各治療組大鼠FBG、FIns、HOMA-IR、OGTT 2 h血糖水平、AUC、SCr、BUN顯著降低（P<0.05，P<0.01）;肝組織p-IRS1 Ser307、p-IRS1 ser612、p-IRS1 ser1101蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）;與二甲雙胍、降糖增效方組比較，聯合組大鼠FBG、FIns、HOMA-IR顯著降低（P<0.05，P<0.01）;OGTT2 h血糖水平以及AUC顯著降低（P<0.05，P<0.01）;肝組織p-IRS1 Ser307、p-IRS1 ser612、p-IRS1 Ser1101蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結論 降糖增效方降低糖尿病大鼠肝臟IRS1 ser307/612/1101位點磷酸化水平，這可能是其增加降糖療效的機制。

〔Abstract〕 Objective To observe effects of Jiangtang Zengxiao Fang （JZF） on phosphorylation of insulin receptor substrates 1 （IRS1） in diabetic rats， and to investigate the mechanism of synergism of reducing blood glucose. Methods A total of 40 6-8 week male ZDF （fa/fa） rats were randomly divided into a model group， a metformin group （0.134 g/kg）， a JZF group （0.64 g/kg）， and a combination group （JZF 064 g/kg + metformin 0.134 g/kg）. Another 10 ZDF （fa/+） rats were set as a normal group. The rats were continuously intervened for 6 weeks. Fasting blood glucose （FBG）， fasting insulin （Fins）， homeostasis model assessment-Insulin resistance （HOMA-IR）， aspartate aminotransferase （AST）， serum creatinine （Scr）， blood urea nitrogen （BUN） and oral glucose tolerance test （OGTT） were detected after experiment. Western blot was used to detect the expression of ser307， ser612， ser1101 in phosphorylation of IRS1 in liver. Results Compared with the model group， FBG， Fins， HOMA-IR， Blood glucose level of 2 h in OGTT， AUC， AST， Scr and BUN in each group were decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. p-IRS1 ser307， p-IRS1 ser612， p-IRS1 ser1101 protein expression level in the liver tissue were decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Compared with JZF group and metformin group， FBG， Fins and HOMA-IR of the combination group were decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Blood glucose level and AUC were significantly decreased at 2 h in OGTT （P<0.05， P<0.01）. p-IRS1 ser307， p-IRS1 ser612， p-IRS1 ser1101 protein expression level in the liver tissue were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion JZF can regulate p-IRS1 ser307， p-IRS1 ser612， p-IRS1 ser1101 expression in liver tissue of diabetic rats， which might be the mechanism of improving the efficacy of reducing blood glucose.

〔Keywords〕 Jiangtang Zengxiao Fang; diabetic model rats; metformin; insulin receptor substance; phosphorylation; insulin signaling pathway

根據國際糖尿病聯盟（international diabetes federation，IDF）2017年統計，目前全球有糖尿病患者4.25億，其中90%為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），預計到2045年，糖尿病患者可能達到6.29億[1]。我國近30年來糖尿病患病率顯著增加，2013年我國糖尿病及糖尿病前期最新流行病學數據顯示，20歲以上成年人糖尿病患病率為10.9%，糖尿病人數已超1億，而且，還有35.7%的糖尿病前期高危人群[2]，糖尿病已成為非常嚴重的公共健康問題。

降糖增效方是在臨床經驗基礎上結合現代藥理研究組方而成的中藥降糖復方，由黃芪、苦瓜、桑葉、玉竹、石斛、三七、神曲、肉桂組成，前期已獲保健食品批準文號（國食健字G20130302）以及國家專利（專利號：ZL2007101060118）。前期實驗表明本品對糖尿病大鼠具有降低血糖、改善胰島素抵抗、保護β細胞、降低血脂作用[3];其主要成分如苦瓜總皂苷、桑葉總黃酮、桂皮醛、三七總皂苷等也有明確降糖、改善胰島素抵抗作用[4-5]。為了進一步探索降糖增效方治療2 型糖尿病的作用機制，本實驗選用降糖增效方干預自發性糖尿病肥胖（zucker diabetes fatty， ZDF）大鼠，觀察其降糖、改善胰島素抵抗的作用，探討其降糖增效作用的機制。

1 材料

1.1? 實驗動物

SPF級雄性自發性2型糖尿病模型ZDF（fa/fa）大鼠40只，6～7周齡，體質量（200±20） g，同周齡正常雄性ZDF（fa/+）大鼠10只，購自北京維通利華實驗技術有限公司，許可證編號：SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所SPF級動物實驗室（實驗動物使用許可證：SYXK 京2010-0032），溫度（23±2） ℃、濕度（55±10）%，12/12 h光照黑暗循環，自由攝食飲水。ZDF（fa/fa）大鼠飼料（蛋白質26.85%，脂肪16.71%，碳水化合物56.44%）喂養，ZDF（fa/+）大鼠普通飼料喂養。通過動物實驗倫理審查（編號2016-006）。

1.2? 藥物與試劑

降糖增效方（10 g/袋，北京中醫藥大學東方醫院顆粒藥房，批號160708）;鹽酸二甲雙胍片（0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號20150109）;血肌酐（serum creatinine，SCr）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號20180602）;血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號20180304）;天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號20180306）;胰島素（fasting insulin，FIns）試劑盒（北京華英生物技術研究所，批號20162400316）;RIPA裂解緩沖液（批號20180404）、BCA蛋白定量試劑盒（均來自北京普利萊基因技術有限公司，批號20180114）;磷酸化胰島素受體底物蛋白1絲氨酸1101/612/307（phospho-insulin receptor substrate 1 Ser1101/Ser612/Ser307，p-IRS1 ser1101/ser612/ser307）、β-actin 抗體（CST公司，批號0005，0003，0005，0021）;羊抗兔二抗（CST公司，批號0026）;Block one/Block one-P（日本京都Nacalai Tesque 公司，批號分別L4E0085，L5G4440）;ECL發光液（美國BIO-RAD公司，批號20170708）。

1.3? 儀器

7160型全自動生化儀（日本日立公司）;r-911型全自動放免計數儀（中國科技大學實業總公司）;E9032型酶標儀（美國Promega公司）;7500型PCR擴增儀（美國ABI 公司）;Mini-PROTEAN型垂直電泳儀、轉移槽、ChemiDocTM XRS+型凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1? 分組與干預

檢測適應性喂養后ZDF（fa/fa）大鼠尾靜脈血糖，不同次隨機血糖≥11.1 mmol/L為成模標準[6]，按血糖隨機分層分為：模型組、二甲雙胍組（0.134 g/kg）、降糖增效方組（0.64 g/kg）、聯合組（二甲雙胍0.134 g/kg+降糖增效方0.64 g/kg），10只/組;10只雄性ZDF（fa/+）大鼠為正常組;按體表面積法折算大鼠給藥劑量[7]，正常組、模型組給等容量生理鹽水，1次/日，連續6周。

2.2? 標本采集

干預6周后，各組小鼠未出現死亡，禁食過夜后，麻醉后腹主動脈取血，離心抽取血清凍存;剖取肝臟，-80 ℃凍存待用。

2.3? 生化指標檢測

取大鼠血清，全自動生化儀檢測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、BUN、SCr、AST;全自動放免計數儀檢測FIns，計算胰島素抵抗指數（homeostaticmodel assessment of insulin resistance，HOMA-IR）。

2.4? 口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）實驗第6周，大鼠禁食12 h，葡萄糖2 g/kg灌胃，尾靜脈取血，分別檢測0、30、60、120 min血糖（blood glucose，BG）并計算曲線下面積（AUC）。

2.5? Western Blot檢測P-IRS1 ser 307、612、1101蛋白表達 每組取6只大鼠肝組織，RIPA裂解提取總蛋白，高溫蛋白變性，檢測蛋白濃度;12% SDS-PAGE 凝膠電泳100 V 1.5 h，半干法轉膜后TBS溶液洗10 min;Blocking one/Blocking one-P封閉30 min，一抗（1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜;洗膜，二抗（1∶10 000）室溫1 h。洗膜后ECL發光液避光孵育2 min，凝膠成像系統顯影，Image J 7.0軟件進行圖像分析，以目的蛋白/內參蛋白灰度值計算蛋白表達水平。

2.6? 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件處理數據，數據用“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法;兩組間比較，滿足方差齊性時用 LSD 檢驗，不滿足方差齊性時用非參數檢驗;P<0.05表示差異有統計學意義，P<0.01表示差異有顯著統計學意義。

3 結果

3.1? 各組大鼠FBG比較

與正常組比較，模型組大鼠FBG水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各治療組大鼠FBG顯著降低（P<0.05，P<0.01）。聯合組大鼠FBG較二甲雙胍組、降糖增效方組顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見表1。

3.2? 各組大鼠FIns、HOMA-IR比較

實驗6周后，與正常組比較，模型組大鼠FIns、HOMA-IR水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各治療組大鼠FIns、HOMA-IR顯著降低（P<0.05，P<0.01）。聯合組大鼠FIns、HOMA-IR較二甲雙胍組、降糖增效方組顯著降低（P<0.01），說明聯合用藥在改善大鼠胰島素抵抗方面效果優于單獨用藥。見表2。

3.3? 各組大鼠OGTT比較

實驗6周后，與正常組比較，模型組大鼠0、30、60、120 min血糖及AUC顯著升高（P<0.01），且血糖最高峰值延后;與模型組比較，各治療組大鼠0、60、120 min血糖及AUC顯著降低（P<0.05，P<0.01）;二甲雙胍組大鼠0、120 min血糖及AUC結果顯著高于聯合組（P<0.05，P<0.01），降糖增效方組0、30、60、120 min血糖及AUC結果顯著高于聯合組（P<0.05，P<0.01）。見表3。

3.4? 各組大鼠肝腎功能比較

實驗6周后，與正常組比較，模型組大鼠血清AST無差異（P>0.05），SCr、BUN顯著增高（P<0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組、降糖增效方組、聯合組大鼠血清AST無差異（P>0.05），SCr、BUN降低（P<0.05，P<0.01）。見表4。

3.5? 各組大鼠肝臟p-IRS1 Ser 307、p-IRS1 Ser 612、p-IRS1 Ser 1101蛋白表達比較

與正常組比較，模型組大鼠p-IRS1 Ser 307/612/1101表達水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各治療組大鼠p-IRS1 Ser 307/612/1101顯著降低（P<0.05，P<0.01）;聯合組大鼠p-IRS1 Ser 307/612/1101表達水平較二甲雙胍組、降糖增效方組顯著降低（P<0.01）。見表5。

4 討論

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是糖尿病發病的主要機制之一，常伴隨著機體高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥等發生，同時也是糖尿病血管、神經系統并發癥發生的原因之一[8]。實驗研究發現，改善糖尿病大鼠胰島素抵抗，能夠降低大鼠血糖、血脂水平，甚至炎癥、氧化應激等狀態[9-10]。中醫藥在治療糖尿病方面積累了豐富的經驗，能夠聯合西藥，發揮協同作用來增強療效，減緩不良反應。中藥降糖增效方是由苦瓜、桑葉、玉竹、三七、肉桂等藥物組成，本方以苦瓜為君藥清虛熱，桑葉、玉竹為臣藥，助苦瓜清虛熱，同時補陰津;三七行血，佐助行散藥力，少量肉桂反佐以防清熱太過、寒涼傷及脾胃。方中藥物配伍得當，益氣與滋陰清熱并重、補瀉同用、寒熱并治，做到滋補而不壅滯、清熱而寒涼，清熱滋陰益氣。前期研究發現，本方能夠作用于糖尿病大鼠骨骼肌胰島素信號傳導通路的胰島素受體、蛋白激酶B、葡萄糖轉運蛋白4等靶點，具有降糖、降脂、改善胰島素抵抗的作用[3]。此外，二甲雙胍作為2型糖尿病的一線用藥[11]，單獨應用往往不能有效控制血糖水平，且易出現胃腸道不良反應及高乳酸血癥等[12]。在本研究發現，降糖增效方能夠改善ZDF大鼠FBG、FIns、HOMA-IR，發揮降糖、改善IR的作用，與二甲雙胍聯合應用降糖效果更佳。

胰島素受體底物1（insulin receptor substance 1，IRS1）是胰島素信號通路連接細胞內外的信號蛋白，其活化水平影響胰島素生理效應的產生[13]。研究發現，IRS1不同位點的磷酸化受蛋白激酶影響從而正性或負性調控胰島素信號傳導[14]，如絲氨酸位點 Ser 307、Ser 612、Ser 1101活化抑制信號傳導，酪氨酸位點Tyr 989活化促進信號傳導。正常情況下胰島素與受體結合前，IRS1以絲氨酸磷酸化為主，關閉向下游傳導信號通路;當胰島素結合細胞表面受體后，IRS1大多數酪氨酸位點磷酸化，競爭性抑制絲氨酸位點磷酸化發生，同時啟動下游信號通路發揮生理效應[15];IR發生的時候，由于長期高胰島素血癥、炎癥、氧化、高糖等狀態存在，導致胰島素與受體結合后，IRS1酪氨酸位點磷酸化減弱，絲氨酸磷酸化作用增強，抑制了胰島素信號傳導進一步加重IR、高糖狀態[16-17]。本研究結果發現，降糖增效方能夠顯著降低大鼠肝臟IRS1 Ser 307、Ser 612、Ser 1101位點的磷酸化，其與二甲雙胍聯合應用效果顯著優于單獨藥物治療組。

綜上所述，降糖增效方能夠降糖、改善IR，其聯合二甲雙胍效果更優，二者聯合應用增加降糖療效，優于兩藥單獨應用;聯合用藥能夠更顯著抑制IRS1絲氨酸磷酸化，因此，可以推斷出聯合用藥發揮降糖增效作用的原因可能是抑制IRS1絲氨酸磷酸化，從而加快胰島素信號傳導實現的。但中西藥聯合應用改善IR的相關報道較少，仍需進一步探討降糖增效方及中西藥聯合應用的作用機制。

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