兩種脾氣虛證模型大鼠臨床證候特征的比較

董一昕 李騰輝 劉燕 孫天石 張楚焌 黃翔 李衛紅

〔摘要〕 目的 對比研究復合因素法與利血平皮下注射法所致脾氣虛證模型大鼠的臨床證候特征。方法 將30只雄性SD大鼠隨機分為正常組、復合因素組及利血平組，分別采用兩種方式造模后，通過一般體征指標及證候量化評分評價臨床證候表現;曠場實驗評價大鼠心理及自主活動;檢測血清D-木糖含量判斷消化吸收能力。結果 與正常組相比，兩模型組大鼠證候量化評分總積分及各單項均升高（P<0.05，P<0.001），且利血平組各個單項及總積分均高于復合因素組（P<0.05）;兩組大鼠自主活動均較正常組減少（P<0.05）;與復合因素組相比，利血平組穿格次數、中央區停留時間、活動距離下降尤為明顯（P<0.001）;與正常組相比，兩組大鼠血清D-木糖含量均下降（P<0.01），兩模型組之間差異無統計學意義（P>0.05）。結論 兩種造模方式都可造成大鼠脾氣虛證候，但其臨床證候表現有所不同，實驗時應結合需求進行選擇。

〔關鍵詞〕 脾氣虛證;動物模型;復合因素法;利血平

〔Abstract〕 Objective To compare the characteristics of clinical syndromes of spleen-Qi deficiency syndromes by compound factor method and reserpine subcutaneous injection method. Methods A total of 30 male SD rats were randomly divided into a normal group， a compound factor group， a reserpine group. After modeling by these two methods， general characteristics of rats and syndrome quantification score was carried out to assess clinical syndromes. Open-field test was operated to evaluate the psychological and autonomous activities of rats. Content of D-xylose in rat serum was detected to evaluate the digestion and absorption function. Results Compared with the normal group， individual and total scores of syndrome quantification in 2 model groups were increased （P<0.05， P<0.001）. The scores in the reserpine group were higher than the compound factor group （P<0.05）. The spontaneous activity of model rats were reduced than that of the normal group （P<0.05）. Compared with the compound factor group， the times of passing through the grille， the duration of staying at the central grille， and the movement distance were decreased significantly in reserpine group （P<0.001）. The serum D-xylose content of the model rats was significantly decreased than that of the normal group （P<0.01）， but there was no significant difference between the 2 model groups （P>0.05）. Conclusion? Both model methods can cause spleen deficiency syndrome in rats， but each has its own clinical syndromes， which could be selected according to experimental requirement.

〔Keywords〕 spleen-Qi deficiency syndrome; animal model; compound factor method; reserpine

脾氣虛證是臨床常見的中醫證候，以面黃食少、便溏或泄瀉、神疲乏力、少氣懶言、舌淡苔白、脈虛弱為臨床辨證要點。近年來對于脾氣虛證的現代病理生理學基礎進行了很多研究，尤其是脾氣虛證動物模型的制備在脾虛證的研究中占有重要作用。自從1979年北京師范大學張啟元教授[1]以“瀉下傷脾”的方式用大黃水煎液灌胃建立小鼠脾虛證模型以來，針對脾氣虛證造模方法的研究日趨豐富。目前常用的造模方法主要有三大類：一是單因素造模法，如中藥灌胃苦寒瀉下法、小平臺站立或力竭游泳等方法;二是多因素復合造模方法，常在飲食失節、過度勞倦、束縛應激、苦寒瀉下等方式中選擇2～3種疊加處理造模[2];三為西藥理化因素造模，如皮下注射利血平法、秋水仙堿飼喂法、X射線照射法等[3]。這些方法都有各自的優勢和弊端。本實驗中從臨床證候表現及生化指標方面對常用的“小承氣湯灌胃+力竭游泳+隔日斷食復合因素造模法”和“利血平皮下注射造模法”進行了對比研究。

1 材料

1.1? 動物

健康雄性SD大鼠30只，體質量（120±20）g，由北京市斯貝福生物有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0002。

1.2? 藥物及試劑

利血平粉末（貨號：RH45599-1g，美國Bioruler公司），小承氣湯配方顆粒（組成：大黃12 g，枳實9 g，枳實9 g，厚樸6 g），每克復方配方顆粒含有6.7 g生藥，由北京中醫藥大學第三附屬醫院提供。冰醋酸（G73562B，上海泰坦化學有限公司）、D-（+）-木糖（RB10118，美國Bioruler公司）、D-木糖測試盒（A035， 南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1? 動物分組

適應性飼養3 d后，將30只大鼠隨機分為3組：正常組、小承氣湯灌胃+力竭游泳+隔日斷食復合因素造模組（簡稱復合因素組）、利血平皮下注射造模組（簡稱利血平組），每組10只。

2.2? 兩種模型制備及正常組處理

復合因素組：采用小承氣湯灌胃、力竭游泳、隔日斷食3種復合因素造模。具體為：將小承氣湯配方顆粒配成0.35 g/mL的溶液，每日上午10：00給予灌胃，給藥劑量為5.25 g/（kg·d），每日下午14：00將動物負載自身體質量10%的重物，放入水深約50 cm、水溫20 ℃的水池中游泳至力竭（即鼻尖完全沒入水面以下5 s以上判斷為力竭狀態）;隔日上午撤去飼料，24 h后再添加飼料。

利血平組：采用利血平皮下注射進行造模。以乙酸溶解利血平配成0.1 mg/mL的利血平乙酸溶液，生理鹽水稀釋后，每天按照0.5 mg/kg的劑量頸部皮下注射給藥。

正常組：不造模，每日以與復合因素組同等容量，用去離子水灌胃，并在頸部皮下注射與利血平組同等容量的生理鹽水，期間正常飲食飲水。

上述3組處理時間均為14 d。

2.3? 指標檢測

2.3.1? 一般情況觀察? 造模期間觀察大鼠一般情況，如日常理毛、毛色、行為狀態、活躍程度、攝食、體質量變化、大便次數與性狀等。

2.3.2? 癥狀量化積分? 利用文獻報道大鼠脾虛證候量化積分量表[4-5]（根據衛生部《中藥治療脾虛證的臨床研究指導原則》[6-7]的相關標準制定），對模型大鼠癥狀進行量化評分。見表1。

2.3.3? 行為學實驗? 造模結束后進行曠場實驗，在安靜的環境下將動物放入曠場箱內底面中心，底面區域被分割成25個4 cm×4 cm的方塊，在正上方2 m處架攝像頭同時進行攝像和計時。觀察大鼠在場內活動情況，記錄并分析各組大鼠在中央區停留時間百分比、曠場內行走格數、站立次數、活動距離等。

2.3.4? 血清D-木糖含量檢測? 行為學檢測結束后，將各組大鼠禁食不禁水飼養24 h，按照1 mg/0.1 kg的劑量灌服3%D-（+）-木糖水溶液，1 h后尾靜脈取血檢測D-木糖含量以評價消化道的吸收功能。

2.4? 統計學處理

數據描述均以“x±s”表示，用ANOVA進行單因素方差分析，均數間兩兩比較用SNK法進行多重比較，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 一般情況觀察

造模期間正常組大鼠活動正常、體格健壯、大便正常、背毛光澤緊密、無掉毛現象;兩模型組大鼠從造模第3天開始出現不同程度的扎堆無力、攝食量減少;在第1周結束時利血平組大鼠開始出現明顯肛周污穢癥狀，而復合因素組癥狀不明顯;兩周造模結束后，復合因素組大鼠消瘦乏力、反應遲緩、大便稀軟、進食量減少;利血平組癥狀更加明顯。見圖1。

3.2? 大鼠癥狀量化評分

各組大鼠體質量變化，兩周內正常組大鼠體質量平穩上升，而兩模型組從造模第3天開始體質量就較正常組有所下降。造模第1周復合因素組大鼠體質量增長速度較利血平組慢，從第2周開始利血平組大鼠消瘦情況明顯，體質量增長速度減慢，從總體變化來看，兩模型組與正常組相比體質量均出現明顯下降。見圖2。

根據量化積分表對動物臨床證候表現進行評價，結果如表2所示，與正常組相比，兩種模型大鼠的大便性狀、攝食量情況、體質量增長率、精神狀況、皮毛情況積分均顯著升高（P<0.05、P<0.01、P<0.001），總積分也顯著高于正常組（P<0.001），說明兩種造模方法均誘導出了脾氣虛證的典型表現。兩模型組之間進行比較，利血平組在各個單項及總積分均高于復合因素組，提示利血平誘導的脾氣虛證癥狀更為明顯。

3.3? 曠場實驗

與正常組比較，兩模型組的各項指標都有明顯變化，其中穿格次數、活動距離、平均速度、站立次數均降低（P<0.05、P<0.01、P<0.001），復合因素組中央區停留時間顯著升高（P<0.01），利血平組，中央區停留時間減少（P<0.01）。兩模型組相比，利血平組穿格次數、中央區停留時間、活動距離顯著小于復合因素組（P<0.001）。各組大鼠典型的運動軌跡如圖3所示，正常組大鼠活動較多，活動區域以角落和四周為主，兩組模型大鼠活動明顯減少，尤其以利血平組變化更為顯著，甚至沒有形成閉合運動區域。復合因素組中心區域活動次數明顯增多。見表3。

3.4? 血清D-木糖含量

D-木糖溶液灌胃1 h后，檢測血清D-木糖含量，可反映大鼠胃腸的吸收功能。造模后兩模型組大鼠血清D-木糖含量均下降，與正常組比較差異具有顯著統計學意義（P<0.01）;而兩模型組之間差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

4 討論

中醫學理論中的“脾”具有主運化、統血、升清功能，藏意主思，為“氣血生化之源”，其生理功能應包括現代醫學中胃、脾、肝膽甚至大腦等臟器的部分生理功能。脾氣虛證是臨床最為常見的證候之一[4]，其病因多為先天稟賦不足、飲食不節、憂思勞倦過度等。現代研究表明脾虛狀態下機體存在胃排空率、胃動素等水平降低[8]，能量代謝下降[9]等多種病理改變。近年來對脾氣虛證的證候實質以及健脾益氣中藥的藥理機制研究日趨豐富，因此建立理想的動物模型尤為重要。

目前脾氣虛證的造模方法多種多樣，大概分為兩大類，一類為模擬中醫脾氣虛證的病因，單一或多因素疊加進行造模，使動物出現符合脾氣虛證的臨床特征，但多因素疊加造模操作規范性不強，模型穩定性欠佳;另一類為西藥理化因素造模，多利用西藥不良反應造成與中醫脾氣虛類似癥狀。以利血平為例，利血平屬于腎上腺能神經阻斷劑，可耗竭動物體內去甲腎上腺素及5-羥色胺等的兒茶酚胺類遞質，出現交感神經功能下降，副交感神經相對亢進的現象，進而表現出“脾氣虛”癥狀，但此造模方式是否能反映脾氣虛證實質還有待進一步研究。因此，本實驗選用多因素復合疊加及利血平注射兩種方式作為常用造模方式的代表，通過大鼠一般情況觀察、癥狀量化評分、行為學實驗、血清D-木糖含量等指標，從臨床證候以及血清生化指標角度進行評價，為脾氣虛證的實驗研究提供參考。

實驗表明兩種模型動物均出現了脾氣虛類似癥狀，癥狀量化評分較正常組有明顯升高。兩模型組比較，利血平組攝食量、大便性狀等各單項指標評分均高于復合因素組，且此組在造模后期便溏嚴重，理毛等自主行為次數明顯降低，皮毛雜亂并粘有較多污穢。

曠場實驗通過大鼠在陌生空曠場地的反應探究大鼠心理和自主活動能力，是目前最常用的行為學監測方法[10]。大鼠進入新環境后的心理基本會經歷緊張、興奮、探索、適應等過程，其活動既表現一定的趨避性，又具有對新事物的好奇性及探索性[11]，故大鼠前期在曠場內因畏懼陌生環境多“貼墻”活動，適應后開始嘗試通過中心區域。其中運動平均速度和運動距離反映了動物的活動情況;中央區停留時間代表動物啟動活動的潛伏時長，反映動物對陌生環境的好奇程度;站立、理毛次數等說明動物對周圍環境的滿意程度，當動物精神不佳或抑郁時其上述指標會有所改變。脾氣虛證常出現倦怠乏力、注意力不集中等精神癥狀可通過曠場實驗加以評測。本實驗結果顯示，正常組大鼠在箱體內活動的區域主要以角落和四周為主，運動距離長，速度快，在中央區域的停留時間較短，后期垂直活動較多;而兩模型組大鼠運動距離縮短，平均速度明顯降低，提示模型大鼠倦怠乏力癥狀明顯;站立次數下降，提示中樞神經系統的興奮性降低;通過比較兩造模組運動距離和穿格次數，提示皮下注射利血平更容易導致動物出現倦怠乏力的癥狀;復合因素組中央區停留時間明顯高于正常組，提示該組大鼠的好奇和探索性較強，而利血平組顯著低于正常組，反映了該組大鼠反應淡漠，喜歡蜷縮趨避。

D-木糖是一種五碳糖，口服后以易化擴散的形式在小腸中的空腸上段吸收[12]，不能被肝臟代謝，最終經過腎臟排出，因而血清D-木糖含量的高低可以良好地反映機體消化吸收機能的變化，這一指標經常作為脾虛模型建立是否成功的參考[5]。本實驗的結果顯示兩種模型大鼠的血清D-木糖含量均明顯降低，說明這兩種造模方法都可造成大鼠消化吸收功能下降。

綜上，兩種造模方式均可使模型動物出現類似“脾氣虛”臨床表現，但復合因素造模法更符合中醫脾氣虛證的病因理論，而利血平組癥狀更為嚴重，尤其是神志功能的改變，利血平組更為明顯。而且在實驗觀察中發現，造模結束后，復合因素組的大鼠在3～4周內大部分癥狀都出現了不同程度的恢復，而利血平組自愈者較少，模型穩定性相對較好。總而言之，傳統的基于中醫病因因素造模方法與利血平皮下注射的造模方式都可以造成實驗動物出現脾氣虛的證候，實驗時應結合需求選擇更合適的造模方法，從而更好地促進脾氣虛證的深入研究。

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