灰褐鏈霉菌對(duì)淀粉糖工業(yè)副產(chǎn)物糖渣發(fā)酵利用的研究

王 楠，周宏霞，楊 揚(yáng)，李 樹

（1.威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東威海 264209；2.山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，山東威海 264209）

在玉米深加工中，淀粉經(jīng)過(guò)液化酶和糖化酶處理后生成葡萄糖。由于淀粉中少量的蛋白質(zhì)和脂肪仍然是不溶性成分，在料液中呈懸浮狀態(tài)，因此需要利用過(guò)濾設(shè)備將其去除，過(guò)濾后得到的固體稱為“糖渣”或“糖糟”。目前，葡萄糖生產(chǎn)企業(yè)大多采用真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)移除蛋白質(zhì)和脂肪，原因在于該設(shè)備自動(dòng)化程度高、處理量大，可以連續(xù)作業(yè)，節(jié)省大量的人力，從而提高生產(chǎn)效率。但是，該設(shè)備在運(yùn)行時(shí)需要在表面預(yù)涂一層硅藻土作為助濾劑，因此糖渣中由于含有大量的硅藻土而失去了作為飼料的價(jià)值，目前尚無(wú)有效方法將硅藻土從糖渣中分離出來(lái)，只能以低廉的價(jià)格作為土壤肥料出售，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，而且糖渣在漚肥過(guò)程中產(chǎn)生難聞的氣味，也帶來(lái)了一定的環(huán)境問(wèn)題。將糖渣作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加入到灰褐鏈霉菌（S.griseofuscus）發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的培養(yǎng)基中[1]，不僅能夠作為碳源和氮源被微生物利用[2]，剩余的硅藻土還能作為助濾劑加快后續(xù)的板框過(guò)濾速率，實(shí)現(xiàn)了將糖渣變廢為寶，降低了生產(chǎn)成本，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)（a）和含硅藻土的糖渣（b）見(jiàn)圖1，糖渣的成分組成及含量（以干基計(jì)算）見(jiàn)表1。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糖渣，西王糖業(yè)有限公司葡萄糖四廠提供；灰褐鏈霉菌，由山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院提供；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、硫酸銨等試劑，均為分析純。

圖1 真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)（a）和含硅藻土的糖渣（b）

表1 糖渣的成分組成及含量（以干基計(jì)算）/ %

（1）固體瓊脂培養(yǎng)基[3]。各成分質(zhì)量濃度為葡萄糖10 g/L，酵母抽提物2 g/L，胰蛋白胨5 g/L，瓊脂20 g/L；初始pH 值7.0，于121 ℃下滅菌20 min。

（2）液體發(fā)酵培養(yǎng)基[4]。各成分質(zhì)量濃度為葡萄糖50 g/L，（NH4）2SO410 g/L，酵母粉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO40.8 g/L，KH2PO41.4 g/L，ZnSO4·7H2O 0.04 g/L；初始pH 值7.0，于121 ℃下滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵中加入糖渣

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入烘干的糖渣，添加量為5 g/L，然后進(jìn)行滅菌[5]。從固體瓊脂培養(yǎng)基上刮取灰褐鏈霉菌的孢子2 環(huán)，無(wú)菌條件下接入50 mL/250 mL的上述培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下以轉(zhuǎn)速200 r/min搖床培養(yǎng)96 h，觀察糖渣的利用情況及檢測(cè)ε-聚賴氨酸含量[6]。

1.2.2 糖渣質(zhì)量濃度為對(duì)灰褐鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入烘干的糖渣，質(zhì)量濃度分別為0，5，10，15，20，25 g/L，然后進(jìn)行滅菌。從固體瓊脂培養(yǎng)基上刮取灰褐鏈霉菌的孢子2 環(huán)，無(wú)菌條件下接入50 mL/250 mL 的上述培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下以轉(zhuǎn)速200 r/min 搖床培養(yǎng)96 h，檢測(cè)ε-聚賴氨酸含量、殘留葡萄糖、菌體量及菌絲球直徑等。

1.2.3 發(fā)酵液中殘留硅藻土對(duì)過(guò)濾效果的影響

使用直徑12 cm 的新華濾紙測(cè)定灰褐鏈霉菌發(fā)酵液的過(guò)濾速度。過(guò)濾條件為單層濾紙、常規(guī)大氣壓，以獲得50 mL 濾液所需的時(shí)間進(jìn)行比較與判定，用時(shí)較短者則過(guò)濾效果好。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰褐鏈霉菌對(duì)糖渣中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的確認(rèn)

糖渣中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂肪，其中葡萄糖是可溶的且為微生物發(fā)酵的通用碳源。蛋白質(zhì)和脂肪是不可溶的，理論上其既可為微生物發(fā)酵提供碳源，又能夠提供氮源，所以首選要確認(rèn)糖渣能否被灰褐鏈霉菌分解利用[7]。在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入烘干的糖渣，質(zhì)量濃度為5 g/L，接種灰褐鏈霉菌后，分別在發(fā)酵的初始0，12，24，36，48，60 h 時(shí)觀察搖瓶中的糖渣。

糖渣在灰褐鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸過(guò)程中的變化情況見(jiàn)圖2。

圖2 糖渣在灰褐鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸過(guò)程中的變化情況

由圖2 可知，由于灰褐鏈霉菌能夠分泌蛋白酶和脂肪酶，可以將胞外的不溶性蛋白和脂肪分解并吸收利用，所以搖瓶中的沉淀，即糖渣會(huì)越來(lái)越少。在發(fā)酵進(jìn)行至48 h 時(shí)，剩余的沉淀已經(jīng)不明顯，而當(dāng)發(fā)酵至60 h 時(shí)，糖渣已經(jīng)被完全分解。研究證明糖渣中的不溶性蛋白質(zhì)和脂肪是能夠作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被灰褐鏈霉菌分解利用的。

2.2 糖渣質(zhì)量濃度為對(duì)灰褐鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響

上述研究中，糖渣質(zhì)量濃度為5 g/L，接下來(lái)對(duì)糖渣質(zhì)量濃度進(jìn)行了不同的發(fā)酵驗(yàn)證，以評(píng)估其對(duì)灰褐鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響。糖渣質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20，25 g/L，并以不添加（0）作為對(duì)照。搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，分別檢測(cè)產(chǎn)物ε-聚賴氨酸、生物量和殘留葡萄糖的質(zhì)量濃度。

糖渣質(zhì)量濃度對(duì)灰褐鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響見(jiàn)表2。

由表2 可知，隨著糖渣質(zhì)量濃度的增加，ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度也隨之增加，在對(duì)照試驗(yàn)中，ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度為1.54 g/L，而糖渣質(zhì)量濃度15 g/L時(shí)，ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到最高值為2.46 g/L，提高幅度為59.7%。但是，當(dāng)糖渣質(zhì)量濃度進(jìn)一步增大時(shí)，ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度反而會(huì)減小，最終在糖渣質(zhì)量濃度25 g/L 時(shí)降低到了1.62 g/L，幾乎與對(duì)照組持平。灰褐鏈霉菌的生物量表現(xiàn)的與ε-聚賴氨酸不同，隨著糖渣質(zhì)量濃度的增加一直在持續(xù)增加，最高達(dá)到了5.75 g/L，是對(duì)照的1.8 倍。研究表明，在灰褐鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加糖渣，不僅能夠作為營(yíng)養(yǎng)被分解利用，還對(duì)ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度有明顯的提高。

表2 糖渣質(zhì)量濃度對(duì)灰褐鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的影響/g·L-1

灰褐鏈霉菌屬于放線菌，是一種絲狀菌，而絲狀菌在培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)形成菌絲球的形態(tài)，這也是絲狀菌的通性。在絲狀微生物的發(fā)酵過(guò)程中，眾多研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物水平的高低和微生物的形態(tài)，即菌絲球的大小有密切關(guān)系[8]。對(duì)于鏈霉菌產(chǎn)ε-聚賴氨酸而言，一般是菌球越小越有利于質(zhì)量濃度的提高。這主要是因?yàn)轭w粒的直徑越小，則比表面積越大，微生物跟營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的接觸就越充分，在高的傳質(zhì)傳氧條件下，細(xì)胞活力很高，結(jié)果就導(dǎo)致了質(zhì)量濃度的提高[9]。而調(diào)控絲狀菌球大小的有效方法之一就是添加無(wú)機(jī)微粒，如氧化鋁、滑石粉等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，糖渣里面含有大量的硅藻土，也屬于無(wú)機(jī)微粒。在搖瓶發(fā)酵中，硅藻土在培養(yǎng)基里進(jìn)行高速轉(zhuǎn)動(dòng)，會(huì)與灰褐鏈霉菌的菌絲發(fā)生碰撞，由此干擾了大尺寸菌絲球的形成，結(jié)果導(dǎo)致了菌球變小。用顯微攝影儀對(duì)搖瓶中菌絲球觀察發(fā)現(xiàn)，不添加糖渣時(shí)，菌球的平均直徑為324 μm，菌球隨著糖渣質(zhì)量濃度增加而減少，當(dāng)糖渣質(zhì)量濃度為20 g/L 時(shí)，菌球直徑降低到了145 μm，這與報(bào)道的結(jié)果是一致的。而當(dāng)糖渣質(zhì)量濃度增大到25 g/L 時(shí)，灰褐鏈霉菌不再以菌球的形態(tài)出現(xiàn)，完全變成了菌絲。試驗(yàn)表明，雖然菌球的直徑變小有利于質(zhì)量濃度的增加，但是當(dāng)小到一定程度，如145 μm 甚至更小時(shí)，ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度反而降低，因此菌球大小應(yīng)當(dāng)適度。此外，菌球變小后，灰褐鏈霉菌雖然產(chǎn)ε-聚賴氨酸降低了，但由于生物量的升高，最終殘留葡萄糖質(zhì)量濃度也在降低。

顯微攝影儀拍攝的灰褐鏈霉菌菌絲球大小見(jiàn)圖3，糖渣質(zhì)量濃度對(duì)菌球直徑的影響見(jiàn)表3。

2.3 發(fā)酵液中殘留硅藻土對(duì)過(guò)濾效果的影響

圖3 顯微攝影儀拍攝的灰褐鏈霉菌菌絲球大小

表3 糖渣質(zhì)量濃度對(duì)菌球直徑的影響

放線菌在發(fā)酵結(jié)束后，要進(jìn)行下游的提取與精制，而過(guò)濾除菌往往是進(jìn)行固液分離的第一步，工業(yè)中常用的過(guò)濾設(shè)備是板框壓濾機(jī)。為了提高過(guò)濾速度，工廠經(jīng)常往板框中預(yù)涂一層硅藻土或者直接把硅藻土加入到發(fā)酵液中。研究中，糖渣中的葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)被灰褐鏈霉菌分解利用，只剩余了硅藻土，所以可以預(yù)見(jiàn)的是，在后續(xù)的板框過(guò)濾中，硅藻土能夠加快過(guò)濾速度。研究采用簡(jiǎn)單的濾紙過(guò)濾方法粗略的測(cè)定了一下加入糖渣（15 g/L）發(fā)酵液的過(guò)濾速度，獲得50 mL 濾液所用的時(shí)間為465±72 s，而不加糖渣的發(fā)酵液，獲得相同體積的濾液所需的時(shí)間為742±85 s，節(jié)省了近40%的時(shí)間，這就意味著在實(shí)際生產(chǎn)可以少加入大量的硅藻土甚至不加入，從而能夠節(jié)省生產(chǎn)成本。

濾紙過(guò)濾發(fā)酵液測(cè)定過(guò)濾速度見(jiàn)圖4。

圖4 濾紙過(guò)濾發(fā)酵液測(cè)定過(guò)濾速度

3 結(jié)論

淀粉糖工業(yè)中，產(chǎn)生了大量含硅藻土的副產(chǎn)物糖渣，目前尚無(wú)有效方法將硅藻土從糖渣中分離出來(lái)，只能以非常低廉的價(jià)格作為土壤肥料出售，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。將糖渣作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加入到灰褐鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，①糖渣中的葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂肪能夠作為碳源和氮源被微生物利用，說(shuō)明處理糖渣的思路是可行的；②糖渣中的硅藻土在發(fā)酵過(guò)程中能夠有效減小灰褐鏈霉菌的菌球直徑，提高了產(chǎn)物ε-聚賴氨酸的質(zhì)量濃度，當(dāng)糖渣質(zhì)量濃度達(dá)15 g/L 時(shí)，ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到最高值為2.46 g/L，提高幅度為59.7%；③剩余的硅藻土還可作為助濾劑加快后續(xù)的板框過(guò)濾速率，能夠節(jié)省新助濾劑的添加量。總之，實(shí)現(xiàn)了將糖渣變廢為寶，降低了生產(chǎn)成本，產(chǎn)生出重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。