大鯢活性肽與低分子量透明質酸組合物抗氧化活性研究

關百婷，佟長青，李 偉

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧大連 116023）

0 引言

透明質酸，又稱玻尿酸，是一種分布于皮膚表皮與真皮中的酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）與葡萄糖醛酸（GlcA）二糖單位重復聚合形成[1]。低分子量透明質酸平均分子量為1×106Da。柯春林等人[2]的研究表明，低分子量的透明質酸具有小鼠巨噬細胞和T 細胞的免疫調節作用。透明質酸因其具有較好的保水作用，已經成為重要的皮膚友好型化妝品原料，被廣泛添加于面膜、乳液、膏霜和化妝水中。同時，利用透明質酸的天然交聯特性，研制出多種透明質酸組合物。柳志喆等人[3]通過膠原蛋白和玻尿酸的天然交聯強化橡膠性質物性的生體材料物質，將膠原蛋白和玻尿酸混合，利用最佳混合比率和非化學性或物理性交聯的天然交聯條件，制作出具有橡膠特性的膠原蛋白和玻尿酸交聯物。陳海佳等人[4]發明了一種間充質干細胞與透明質酸的組合物，該組合物具有快速起效和間充質干細胞作用時間長的優點。Scott J E 等人[5]利用電子顯微鏡和計算機模擬等方法進行研究，發現透明質酸具有三級網狀結構。透明質酸的這些特性為其開發成活性物質的載體提供了巨大的潛力。

研究表明，大鯢肌肉中含有粗蛋白17.15%，水分84.04%，粗脂肪1.73%，灰分0.66%[6]。因此，大鯢肌肉具有較高的蛋白含量。大鯢肉的深度利用是通過酶解技術來實現。大鯢蛋白質經過蛋白酶水解獲得的大鯢肽，往往具有多種生物活性，如增強免疫力、抗氧化、促進細胞增殖等[7-8]。為了探討在化妝品領域應用大鯢活性肽進行了大鯢活性肽與透明質酸組合物的制備，并對其抗氧化活性進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢活性肽，分子量1 400～2 000 Da，由遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室制備；低分子量透明質酸（LMWHA-145 kDa），深圳潤朗醫藥科技有限公司提供；2,2-二苯基-1-苦肼基自由基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH·）（AR）、2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽 （2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid）diammonium salt，ABTS）（AR），美國Sigma 公司提供。

傅里葉變換紅外光譜儀，珀金埃爾默儀器有限公司產品；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；FW-5A 型手動壓片機，天津博天勝達科技發展有限公司產品；UV-754 型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鯢活性肽與LMWHA 組合物的制備

將大鯢活性肽溶于pH 值為6 的濃度為0.01 mol/L PBS 中，制成質量分數10%的溶液。將LMWHA 溶于pH 值為6 的0.01 mol/L PBS 中，制成質量分數10%的溶液；按照1∶1 的體積，將上述2 種溶液混合，經過納濾膜過濾，將濾液進行冷凍干燥，得到大鯢活性肽與透明質酸組合物。

1.2.2 紅外光譜及顯微鏡觀察

稱取0.8 g 溴化鉀、0.002 g 大鯢活性肽與透明質酸組合物、0.002 g 大鯢活性肽、0.002 g 透明質酸于干燥皿中，置于105 ℃烘箱中烘干至恒質量；稱取0.2 g 溴化鉀于瑪瑙研缽中研磨至超細粉末進行壓片，使其成為透明片，放于紅外機器中掃描為背景片，然后稱取0.2 g 溴化鉀與0.002 g 樣品，混合后放于瑪瑙研缽中研磨至超細粉末，進行壓片后放入Frontier FT-IR 光譜儀（Perkin-Elmer）中測定樣品的FT-IR 光譜。

將大鯢活性肽與透明質酸組合物溶于ddH2O 中，配制成質量分數10%的溶液，置于光學顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 DPPH·清除率的測定

將樣品配成質量濃度為5 mg/mL 的混合溶液。稱取10 mg DPPH 溶于無水乙醇中，定容至250 mL，配制成DPPH 工作液。分別加入不同濃度的樣品溶液3 mL，DPPH 工作液3 mL，混勻，置于避光環境中靜置30 min，在波長517 nm 處測定吸光度。按如下公式計算DPPH·清除率：

式中：A0——未加入樣品時DPPH 吸光度；

A1——未加入DPPH 時樣品的吸光度；

A2——樣品與DPPH 混合后的吸光度。

1.2.4 ABTS+·清除率測定

稱取0.020 6 g ABTS+·溶于5 mL 蒸餾水中，稱取0.003 5 g 過硫酸鉀溶于5 mL 蒸餾水中混勻暗反應12 h 后，用蒸餾水稀釋到波長734 nm 處吸光度為0.7±0.02，用蒸餾水調零。分別加入不同質量濃度的樣品溶液1 mL，ABTS 工作液4 mL，振蕩搖勻，室溫靜置6 min 后，在波長734 nm 處測吸光度。按如下公式計算ABTS+·清除率：

式中：A0——未加入樣品時ABTS 吸光度；

A1——未加入ABTS+·時樣品的吸光度；

A2——樣品與ABTS+·混合后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 大鯢活性肽與LMWHA 組合物的分析

將質量分數10%的大鯢活性肽的磷酸鹽緩沖液溶液與質量分數10%的LMWHA 磷酸鹽緩沖液溶液按照1∶1 的體積進行混合，冷凍干燥后得到大鯢活性肽與LMWHA 組合物。對其進行紅外光譜分析，紅外光譜的譜帶數目、形狀、位置及強度都隨著被分析物質的結構改變而改變。

紅外掃描圖譜見圖1。

圖1 紅外掃描圖譜

從圖1 可以看出，大鯢活性肽與LMWHA 組合物與LMWHA、大鯢活性肽的紅外光譜圖具有較大的差別。大鯢活性肽的紅外光譜在3 528～2 867 cm-1表現出較寬的吸收峰，同時具有1 657，1 457，1 415，1 329，1 256，1 096，1 020，851，605 cm-1的特征峰，1 415 cm-1吸收為CN 伸縮及部分NH 彎曲振動。LMWHA的紅外光譜特征吸收為3 408，2 880，1 624，1 508，1 409，1 292，1 240，1 209，1 157，1 065，909，897，622 cm-1的特征峰，其中1 624，1 409，622 cm-1為酰胺特征振動峰，1 157，1 065，909 cm-1表明具有C-O-C 化學鍵，3 408 cm-1為羥基振動峰。大鯢活性肽與LMWHA 組合物的特征峰為3 385，3 060，2 942，1 675，1 533，1 457，1 409，1 317，1 248，605，589 cm-1，這些特征峰即不同于大鯢活性肽的紅外光譜，也不同于LMWHA 的紅外光譜。這表明 2 種物質形成組合物時其 O-H，N-H，C-O-C，C=O 都受到相互作用，說明該組合物是一種新的物質。

將10%的溶于ddH2O 中的大鯢活性肽與LMWHA組合物溶液，置于光學顯微鏡下進行觀察。

大鯢活性肽與LMWHA 組合物顯微照片（放大40 倍）見圖2。

圖2 大鯢活性肽與LMWHA 組合物顯微照片（放大40 倍）

從圖2 可以看出，大鯢活性肽與LMWHA 組合物表現出自然交聯形成的結構。

2.2 抗氧化活性測定

DPPH·與ABTS+·是常規使用的基于電子轉移原理進行抗氧化活性的方法[9]。利用DPPH·方法測定的大鯢活性肽與LMWHA 組合物抗氧化活性，并與大鯢活性肽、LMWHA。

樣品質量濃度對DPPH·的清除率的影響見圖3。

圖3 樣品質量濃度對DPPH·的清除率的影響

從圖3 可以看出，在相同質量濃度下，大鯢活性肽與LMWHA 組合物的清除DPPH·的能力與大鯢活性肽清除DPPH·的能力相當。

利用ABTS+·方法測定的大鯢活性肽與LMWHA組合物抗氧化活性，并與大鯢活性肽、LMWHA。

樣品質量濃度對ABTS+·的清除率的影響見圖4。

圖4 樣品質量濃度對ABTS+·的清除率的影響

從圖4 可以看出，在相同質量濃度下，大鯢活性肽與LMWHA 組合物的清除ABTS+·的能力顯著高于大鯢活性肽清除ABTS+·的能力。

溶劑對于DPPH·與ABTS+·方法測定抗氧化活性具有較大的影響。2 種方法的主要差別在于DPPH·需要利用乙醇來進行溶解，而ABTS+·用水溶液來進行溶解。在水溶液的環境下，大鯢活性肽與LMWHA組合物的抗氧化能力顯著提高。這也從另一個方面證明了大鯢活性肽利用LMWHA 的有三級網狀結構，發揮了更好的抗氧化活性。

3 結論

在pH 值為6 的條件下，等量的大鯢活性肽與LMWHA 在溶液中形成了組合物。該組合物的紅外光譜呈現出了其獨特的吸收峰。顯微鏡觀察到大鯢活性肽與LMWHA 組合物表現出自然交聯形成的結構。在相同質量濃度下，大鯢活性肽與LMWHA 組合物清除DPPH·的能力與大鯢活性肽清除DPPH·的能力相當，大鯢活性肽與LMWHA 組合物的清除ABTS+·的能力顯著高于大鯢活性肽清除ABTS+·的能力。因此，在大鯢活性肽與LMWHA 組合物中，大鯢活性肽利用了LMWHA 的有三級網狀結構，發揮了更好的抗氧化活性。