蜂膠對調節(jié)小鼠免疫功能的影響

喻建輝，周明良，余春濤，江平嶼

（江西汪氏蜜蜂園有限公司，江西南昌 330100）

0 引言

蜂膠是蜜蜂中的工蜂從植物的嫩芽及樹干上采集的樹脂或者其他分泌物，通過與自己上顎腺分泌的一類物質混合形成的膠狀固體物質，該物質具有強烈的殺菌功能[1-3]。蜂膠不是蜜蜂的營養(yǎng)物質，而是蜜蜂主要利用其來構筑蜂巢、堵塞縫隙、增加巢脾的韌性、防御入侵者等[4]。常溫狀態(tài)下，蜂膠為不透明的固態(tài)，具有一定的芳香氣味，色澤呈褐色、黃褐色或者黑色，如果保存時間較長也會出現(xiàn)紅棕色，折斷的橫截面類似砂粒，與大理石的切面比較類似，滋味略苦，蜂膠的黏性較大，熔點約為65 ℃，密度稍大于水，不溶于水，易溶于丙酮、酒精等有機溶劑[5]。從主要物質方面來說，新采集的蜂膠中主要有樹脂和香脂，另外還有一部分蜂蠟，此外就是花粉夾雜物和揮發(fā)芳香油等物質，蜂膠的化學成分主要取決于蜜蜂采集樹膠地區(qū)的植物[6]。從化學成分上分析，蜂膠主要有黃酮類物質、氨基酸、多糖、酶和植物激素等物質。

蜂膠作為一種傳統(tǒng)的藥品和保健品，早在3 000 多年前就有應用，古埃及人就利用蜂膠的特性來作為防腐材料制作木乃伊，亞里士多德也在他的巨著《動物志》中有記載蜂膠可以治療化膿性潰瘍、創(chuàng)傷感染等皮膚疾病，塞爾蘇斯也在《醫(yī)學論》中記錄了蜂膠可以促進傷口化膿，加快傷口愈合[7]。隨著現(xiàn)代科學的進步，對蜂膠的研究也越來越深入，其藥用價值也逐漸被挖掘，現(xiàn)在主要應用于抗氧化、殺菌消炎、提高免疫力、輔助降血糖、調節(jié)血脂等醫(yī)療、保健方面[8-9]。

試驗通過采用不同劑量的蜂膠灌胃小鼠，通過觀察其體重的變化，臟器/體重的比值、NK 細胞活性率、淋巴細胞轉化率、半數(shù)溶血值和抗體生成細胞數(shù)來研究蜂膠對小鼠免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1 樣品

蜂膠軟膠囊，江西汪氏蜜蜂園有限公司提供，其中內容物中蜂膠的比例為25%，于4 ℃下保存，供試驗用。

1.2 試驗動物及環(huán)境

SPF 級昆明種雌性小鼠 80 只，體重18～22 g，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部提供，飼料也由該單位提供，試驗共分為兩大組，每大組有小鼠40 只，免疫1 組進行NK 細胞的活性測定、進行ConA 誘導的小鼠淋巴細胞轉化試驗；免疫2 組，進行臟體比值測定、半數(shù)溶血值（HC50）的測定和抗體生成細胞數(shù)的測定。試驗期間，控制環(huán)境溫度為23～24 ℃，濕度為 52%～56%。

1.3 劑量設計

人體每日推薦攝入量為2.0 g/日，劑量的設計需參考人體，以其每日推薦量來確定，其每日推薦攝入量為2.0 g/日，相對劑量設計來說，即0.033 g/kg·bw，根據(jù)該推薦量設置3 個劑量組：5 倍的低劑量組0.167 g/kg·bw，10 倍的中劑量組 0.333 g/kg·bw，30 倍的高劑量組1.000 g/kg·bw，分別取汪氏蜂膠軟膠囊內容物3.34，6.66，20.00 g，加植物油定容至200 mL，按0.1 mL/10 g·bw 體積給小鼠灌胃，對照組給予相同體積的植物油。每天1 次，連續(xù)灌胃至少30 d。

1.4 儀器與試劑

動物臺秤、潔凈工作臺、分析天平、離心機、恒溫水浴箱、酶標儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、722 型分光光度計、顯微鏡等；無菌手術器械、游標卡尺、微量注射器、細胞計數(shù)器、24 孔和96 孔平底細胞培養(yǎng)板，96 孔U 型細胞培養(yǎng)板、玻璃平皿、紗布、試管、玻片架、200 目篩網(wǎng)、計時器、血色素吸管、載玻片等。

SRBC、生理鹽水、Hank's 液、RPMI1640 培養(yǎng)液、小牛血清、青鏈霉素、ConA、1%冰醋酸、1 mol/L的HCl 溶液、酸性異丙醇、MTT、PBS 緩沖液（pH 值7.2～7.4）、補體（豚鼠血清）、SA 緩沖液、瓊脂糖、都氏試紙、YAC-1 細胞、乳酸鈉、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶Ⅰ、0.2 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液、2.5%Triton、印度墨汁、0.1%的碳酸鈉、雞紅細胞、甲醇、Giemsa 染液等。

1.5 試驗方法

1.5.1 臟器/ 體重比值測定

稱質量后處死小鼠，取出脾臟和胸腺，在電子分析天平上稱質量，計算臟/體比值。

1.5.2 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化試驗（MTT 法）

取脾，制成細胞懸液，細胞懸液需要經過200 目的篩網(wǎng)過濾，將小鼠的脾臟在無菌環(huán)境下取出，放在裝有適量無菌Hank's 液的小平皿中待用，用Hank's清洗2～3 次。再以轉速1 000 r/min 離心10 min。活細胞計數(shù)就采用上述處理的細胞懸液，細胞懸液處理好后，放在1 mL 完全培養(yǎng)液中，細胞濃度一般用RPMI1640 培養(yǎng)液調整設置在3×106個/ mL，經過濃度調整后的細胞懸液分成2 孔，加入24 孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，在其中一孔加75 μL ConA 液（相當于7.5 μg/mL）；另一孔作為對照，培養(yǎng)時間設置為72 h，培養(yǎng)環(huán)境中需要5%二氧化碳，溫度控制為37 ℃。在培養(yǎng)時間結束前4 h，要吸取上清液0.7 mL，用不含小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液0.7 mL 來補充；與此同時，還應該加入MTT（5 mg/mL）也就是相當于50 μL/孔的量繼續(xù)培養(yǎng)，時間為4 h。要在培養(yǎng)結束時加入酸性異丙醇，每孔加入1 mL，攪打混勻，攪打輕輕吹氣即可，使得紫色結晶的物質完全溶解。溶解后才能分裝在培養(yǎng)板中，每個培養(yǎng)板為96 孔，每個孔都需要作平行，數(shù)目為3 個，測定光密度使用酶標儀，設置波長570 nm。淋巴細胞的增殖能力就可以用光密度來表示，也就是用ConA 孔的光密度減去不加ConA 孔的光密度。

1.5.3 抗體生成細胞檢測（Jerne 改良玻片法）

使用生理鹽水洗滌羊血2～3次，再以轉速2000r/min離心10min，用生理鹽水配成一定質量分數(shù)的細胞懸液SRBC，質量分數(shù)為2%（V/V），每只鼠以腹腔注射的方式注射0.2 mL。4 d 后將小鼠處死，取脾，制成細胞懸液，細胞懸液需要經過200 目的篩網(wǎng)過濾，將小鼠的脾臟在無菌環(huán)境下取出，放在裝有適量無菌Hank's 液的小平皿中待用，取脾，在無菌環(huán)境下將小鼠的脾臟取出，小平皿中裝有適量無菌Hank's 液，活細胞計數(shù)就采用上述處理的細胞懸液，細胞懸液處理好后，放在8 mL 完全培養(yǎng)液中，細胞濃度一般用RPMI1640 培養(yǎng)液調整設置為5×106個/ mL。微微較熱表層培養(yǎng)基，用2 倍濃度的Hank's 液與表層培養(yǎng)基等量混合，Hank's 液酸堿度應調節(jié)為pH 值7.4，混合后，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內加入用 SA 液配制的 10% SRBC 20 μL（V/V）、20 μL脾細胞懸液（5×106個/ mL），懸液快速混合后，盡量快地倒在刷有薄層瓊脂糖的玻片上，玻片扣在玻片架上，應保持水平，等待待瓊脂糖凝固，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育，溫育時間為1.5 h，然后用SA液稀釋的補體，補體比例為（1∶8）加入到玻片凹槽內，繼續(xù)溫育1.5 h 后，計數(shù)溶血空斑數(shù)來表示抗體生成水平。

1.5.4 半數(shù)溶血值（HC50）的測定

取羊血，血樣需要用生理鹽水清洗2～3 次，用生理鹽水配成一定質量分數(shù)2%的細胞懸液（V/V）的SRBC，每只鼠以腹腔注射的方式注射0.2 mL。4 d 后，以摘除眼球的方式取血樣，樣品血不能立即處理，待血樣品凝固后從管壁上取出，以轉速2 000 r/min 離心10 min，充分分離血清樣，收集血清。用SA 稀釋血清至200 倍，取1 mL 置試管內，用SA 緩沖液配制 10% （V/V）SRBC 和補體 （1∶8）分別加入0.5 mL 和1 mL。對照管用SA 緩沖液。置恒溫水浴中保溫，溫度37 ℃，時間30 min，保溫后使用冰浴停止反應。以轉速2 000 r/min 離心10 min，取上清 1 mL，加都氏試劑 3 mL。SRBC 用 10%（V/V）SA 緩沖液配制，使用0.25 mL，空白對照用等量的都氏試劑，分別測定各管光密度值，測定波長為540 nm。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下式計算：

1.5.5 NK 細胞活性的測定（乳酸脫氫酶測定法）

用頸椎脫臼的方法處死受試小鼠，取小鼠的脾臟作為觀察對象，在無菌環(huán)境下操作，小心取出脾臟并碾碎，用Hank's 液洗2～3 次碾碎的脾臟，制成細胞懸液，以轉速1 000 r/min 處理細胞懸液10 min，分層后棄去上清液，用滅菌水0.5 mL 處理20 s 使紅細胞裂解；再加入0.5 mL Hank's 液及8 mL Hank's液，以轉速1 000 r/min 離心10 min 即可，再進行重懸處理，取質量分數(shù)為10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，1 mL 處理即可，計數(shù)前用1%冰醋酸稀釋，計數(shù)活細胞采用臺盼藍染色的方法，（活細胞數(shù)在95%以上的樣品才可以采用），細胞用量根據(jù)試驗內容調整為2×107個/ mL，這個也就是要用的生長良好的YAC-1 細胞效應細胞，可以用作有效的試驗，這些細胞經過傳代24 h 才能使用，需要使用RPMI1640 完全培養(yǎng)液，細胞用量調整為4×105個/mL，得到要用的靶細胞；靶細胞和效應細胞都取100 μL（由于濃度的不同，所以對應的效靶比為50∶1），取好后混勻加入U 型培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板使用96 孔；靶細胞自然釋放孔先加靶細胞100 μL 攪拌，之后再加入培養(yǎng)液100 μL 混合均勻，靶細胞最大釋放孔先加靶細胞100 μL 攪拌，之后再加入質量分數(shù)2.5% Triton 100 μL，這些孔都需要設置平行孔，一般要設置3 個，處理好后放在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h（二氧化碳體積分數(shù)5%，培養(yǎng)溫度37 ℃），然后將96 孔培養(yǎng)板以轉速1 500 r/min 離心5 min 處理，吸取每個孔的上清液100 μL，同樣放在平底96 孔的培養(yǎng)板中培養(yǎng)一段時間；此外，LDH 基質液也要及時加入等量的覆蓋混勻，由于室溫的不同，一般反應3～10 min，每孔加入濃度為1 mol/L 的HCl 溶液30 μL，在酶標儀處測定光密度（OD），測定波長設置為490 nm。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)需要經過轉化和統(tǒng)計分析，試驗中采用Excel，Spss 軟件進行。用Spss 軟件分析時，如果方差齊、波動較小，應在單因素方差分析之后，再進行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異的時候要用Dunnett 法對劑量組進行比較。如果方差不齊，此時對原始數(shù)據(jù)進行適當?shù)霓D化，這樣可使數(shù)據(jù)滿足方差整齊性，用轉換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；如果達不到方差齊，則改用秩和檢驗進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)總體比較有差異，采用Tamhane's T2檢驗進行兩兩比較，該方法不要求方差齊性。

2 結果與分析

2.1 樣品對正常小鼠體重的影響

免疫1 組小鼠體重見表1，免疫2 組小鼠體重見表2。

表2 免疫2 組小鼠體重（X±s）

由表1 和表2 可知，各劑量組在體重方面，從試驗初期、中期、末期來看與對照組比較，差異性均無顯著性（p>0.05）。

2.2 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值影響見表3。

表3 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值影響（±s）

表3 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值影響（±s）

組 別 動物數(shù)/只脾臟/體重/% p 值 胸腺 /體重/% p 值對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 0.488±0.070 0.505±0.088 0.524±0.111 0.541±0.071 0.685 0.328±0.051 0.345±0.052 0.359±0.070 0.360±0.058 0.594

由表3 可知，樣品各劑量對小鼠脾臟/體重比值和胸腺/體重比值無顯著影響（p>0.05）。

2.3 樣品對小鼠細胞免疫功能的影響

樣品對小鼠淋巴轉化能力的影響見表4。

由表4 可知，樣品高劑量組小鼠淋巴細胞轉化能力明顯高于對照組（p<0.05）。

表4 樣品對小鼠淋巴轉化能力的影響（X±s）

2.4 樣品對體液免疫的影響

2.4.1 樣品對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響

樣品對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響見表5。

表5 樣品對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響（X±s）

由表5 可知，高劑量組小鼠抗體生成細胞數(shù)與對照組比較顯著提高（p<0.05）。

2.4.2 樣品對小鼠半數(shù)溶血值（HC50）的影響

樣品對小鼠半數(shù)溶血值見表6。

表6 樣品對小鼠半數(shù)溶血值（X±s）

由表6 可知，高劑量組小鼠半數(shù)溶血值（HC50）與對照組比較顯著提高（p<0.05）。

2.5 樣品對小鼠NK 細胞活性的影響

樣品對小鼠NK 細胞活性的影響見表7。

表7 樣品對小鼠NK 細胞活性的影響（X±s）

由表7 可知，中、高劑量組小鼠NK 細胞活性與對照組比較顯著提高（p<0.05）。

3 結論

在實驗室條件下，經口灌胃給予小鼠0.167，0.333，1.000 g/kg·bw 劑量的汪氏蜂膠軟膠囊 30 d，與對照組比較0.333，1.000 g/kg·bw 劑量能顯著提高小鼠NK 細胞活性，1.000 g/kg·bw 劑量能顯著提高小鼠半數(shù)溶血值、抗體生成細胞數(shù)、淋巴細胞轉化能力（p<0.05），各劑量對小鼠體重增長、胸腺/體重比值、脾臟/ 體重比值均無明顯影響（p>0.05）。表明蜂膠具有增強小鼠免疫力的功能。

綜上所述，蜂膠在對小鼠免疫功能的影響有一定的調節(jié)作用，正常小鼠在灌食一定劑量的蜂膠后，其體重并未發(fā)生明顯變化，臟器/體重比值也未觀察到明顯變化。中、高劑量的蜂膠能明顯提高小鼠NK細胞活性，高劑量蜂膠能明顯提高小鼠半數(shù)溶血值、抗體生成細胞數(shù)、淋巴細胞轉化能力。

蜂膠中的化學成分非常復雜，其中的生物活性物質也極其豐富，尤其以黃酮類物質為代表，這些生物活性物質也就構成了蜂膠具有各種生物活性保健功能的基礎。現(xiàn)代研究表明[10-12]，蜂膠的多種生理學活性主要依賴于其復雜的化學成分，而免疫調節(jié)活性是蜂膠發(fā)揮多種生理學功能的基礎。然而，蜂膠對機體的保護并不是簡單的一種或幾種生物活性物質的作用，其機理也相當復雜。不同植物來源的蜂膠含有的生物活性物質也不盡相同，就目前的研究來說，蜂膠中已經發(fā)現(xiàn)的化學成分有黃酮類、萜烯類、酮類、醇類、酯類、酚類、有機酸、氨基酸及少量的維生素和礦物質，其中黃酮類和萜烯類是蜂膠極為重要的特征性物質；現(xiàn)代研究表明，已經分離鑒定出蜂膠中黃酮類物質有白楊素、芹菜素、金合歡素、槲皮素、高良姜素、蘆丁、山奈酚、山萘甲黃素等有效物質，其中5,7-二羥基-3,4-二甲基黃酮和5-羥基-4,7-二甲氧基雙氫黃酮是蜂膠的特征性物質[13]。關于植物類黃酮化合物生物活性是近年來研究的特點內容，也是黃酮化學中發(fā)展較快的一個方面[14]。

我國蜂膠資源較為豐富，近幾年毛膠的產量保持在300～400 t，提純的蜂膠可達到150 t 左右，但我國的蜂膠質量問題卻一直困擾著消費者和生產企業(yè)，無論是嚴重的摻假現(xiàn)象還是獸藥殘留或者重金屬超標等問題一直都亟待解決，限制和阻礙了我國蜂膠產業(yè)的發(fā)展，這是由我國長期以來存在的基礎研究薄弱、科技含量不高、市場發(fā)育不良、監(jiān)管力度不夠等大環(huán)境造成的[15-16]。目前，我國的蜂膠保健品種類繁多，但主要集中在免疫調節(jié)、輔助降血糖、調節(jié)血脂等方面，尤其以免疫調節(jié)的種類最多，比例超過50%。但作為蜂膠保健食品的更進一步的發(fā)展來說，具有科技含量才能使得蜂膠在保健食品行業(yè)中占有核心競爭力，這便對蜂膠的研究提出了更高的要求。從蜂膠的分離純化、功能因子的分離到功能因子的作用機理，從蜂膠原料的質量保證到蜂膠作為保健食品的安全性評價來說，這都是亟需解決的問題，相信經過不懈探索和研究，一定能提高蜂膠研究的科技創(chuàng)新能力，開發(fā)出功能更明確、功效更顯著，同時也能保證產品的安全性的蜂膠保健食品。