正性共刺激分子ICOS/ICOSL、OX40/OX40L對老年2型糖尿病免疫炎癥的調節作用

林媛媛 黃雪梅 鄒欣婷 韋海濤 張海燕

(1南寧市第一人民醫院內分泌科，廣西 南寧 530021；2云南省第一人民醫院)

2型糖尿病是一種較為常見的慢性、終身性疾病，發病率較高，發病率隨年齡的增加而增加，在世界范圍內，我國糖尿病位于第二位，僅次于印度〔1,2〕。在以往關于老年2型糖尿病的臨床研究中，中心環節為胰島素抵抗、胰腺β細胞功能下降、遺傳等，近年來臨床研究發現2型糖尿病也屬于一種免疫相關性炎癥疾病，在2型糖尿病發生、發展的整個過程中，異常的機體免疫調節發揮著重要作用〔3,4〕。大量臨床研究表明，2型糖尿病與免疫調節紊亂緊密關聯，且多認為2型糖尿病與B細胞增殖分化、功能異常等有關，而B細胞免疫應答與T細胞密不可分，其中B細胞抗體主要由CD4+T細胞產生〔5,6〕。ICOS/ICOSL、OX40/OX40是T細胞、B細胞活化的主要協同刺激信號，在機體免疫應答反應中有重要的調節作用〔7〕。以往關于老年2型糖尿病免疫炎癥的研究多集中于OX40/OX40的研究，關于ICOS/ICOS的研究涉及較少。本研究旨在探討正性其刺激分子ICOS/ICOSL、OX40/OX40對老年2型糖尿病免疫炎癥的調節作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1病例資料 南寧市第一醫院2017年1月至2018年1月收治的老年2型糖尿病患者中隨機選取40例，設為研究組，納入與排除標準如下：①納入經美國糖尿病協會制定的標準確診為2型糖尿病者；②納入無嚴重并發癥者；③排除合并其機體器官疾病者；④排除合并其他血液系統、免疫系統、精神疾病者。其中男23例，女17例；年齡61～78歲，平均(71.52±6.87)歲；病程1～10年，平均(5.51±3.42)年。另隨機選取同期于本院接受體檢的健康人員40例，男22例，女18例；年齡62～76歲，平均(69.51±6.88)歲。兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。兩組均簽署知情同意書，且醫院醫學倫理會已批準此研究。

1.2儀器與試劑 流式細胞分析儀、離心機均購自Beckman Coulter，流式抗體、乙二胺四乙酸、紅細胞裂解液、磷酸緩沖鹽溶液均購自BD公司。

1.3檢測方法 兩組受檢者處于空腹狀態下時，采集的外周血液標本2.0 ml，通過乙二胺四乙酸展開抗凝處理，將抗凝處理后的血液標本于兩支EP管中加入，各0.05 ml，按1∶100的比例將相關流式抗體加入：第一管中分別將CD4-FITC、抗人ICOE-PE、抗人OX40-PERCP、抗人CD40L-APC抗體加入，第二管中分別將抗人CD19-FITC、抗人ICOSL-PE、抗人OX40L-PERCP、抗人CD40-APC、抗人OX40-FITC抗體加入，避光，進行0.5 h的孵育，展開離心處理，5 000 r/min，共2 min，將上清去除，加入1.0 ml磷酸鹽緩沖液進行洗滌，將紅細胞裂解液加入，避光進行10 min的孵育，再次行離心處理，5 000 r/min×2 min，去除上清，通過磷酸鹽緩沖液進行洗滌，再次加入磷酸鹽緩沖液展開重懸處理，通過流式細胞分析儀進行檢測。

1.4觀察指標 ①兩組B細胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達情況。②兩組CD4+T細胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達情況。③研究組存在大血管病變與無大血管病變患者ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達情況。④研究組ICOS/ICOSL與dsDNA抗體、IgG抗體的相關性，研究組OX40/OX40與抗核抗體水平的相關性。

1.5統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗，χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩組B、CD4+T細胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達 研究組B、CD4+T細胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組B、CD4+T細胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達對比

2.2研究組合并大血管病變與未合并者ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達對比 合并大血管病變的患者B細胞、CD4+T細胞上ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達均顯著高于未合并大血管病變者(P<0.05)，見表2。

病情nB細胞ICOS/ICOSLOX40/OX40LCD4+T細胞ICOS/ICOSLOX40/OX40L未合并大血病變231.96±0.3210.82±2.110.97±0.140.86±0.12合并大血管病變172.69±0.2716.78±1.011.65±0.331.31±0.20t/P值7.609/0.04010.746/0.0318.889/0.03818.718/0.029

2.3研究組ICOS/ICOSL、OX40/XO40L表達與抗體相關性 研究組ICOS/ICOSL與dsDNA抗體(r=0.817，P<0.05)、IgG抗體呈正相關(r=0.863，P<0.05)；研究組OX40/OX40L與抗核抗體水平呈正相關(r=0.971，P<0.05)，見圖1。

圖1 ICOS/ICOSL、OX40/OX40L表達與抗體相關性

3 討 論

2型糖尿病是其中常見的一種類型，占90.0%～95.0%〔8〕。2型糖尿病即非胰島素依賴型糖尿病，發生主要受遺傳、環境等因素影響，近年來大量臨床研究表明2型糖尿病的發生與炎癥、免疫遺傳異常有關〔9，10〕。相關臨床研究對老年2型糖尿病患者進行研究時，可見其促炎細胞因子、急性時相蛋白等水平上升，表明老年2型糖尿病的發生、發展受炎癥因子影響。2型糖尿病患者有T細胞、巨噬細胞活化存在，會致使胰島炎癥放大，而T淋巴細胞屬于機體主要免疫細胞群〔11〕。相關臨床研究表明，老年2型糖尿病患者的CD3+、CD4+細胞水平均下降，且CD4+/CD8+失衡，進一步證實了2型糖尿病與細胞免疫功能的聯系〔12〕。另有研究者發現2型糖尿病患者Th1/Th2失衡，Treg水平下降，表明2型糖尿病T細胞亞群存在異常，具有免疫調節作用的細胞數量、功能均有異常〔13〕。同時，2型糖尿病患者也存在炎癥反應，主要表現為由B細胞進行分泌的IL-8(促炎細胞因子)水平上升，IL-10(抗炎細胞因子)水平下降，表明在2型糖尿病中B細胞功能失調也有參與。

人ICSO基因處于染色體2g33上，CD28-CT-LA-ICOS與多個自身免疫性疾病相關，如2型糖尿病、紅斑狼瘡等〔14〕。ICOS可對活化的T細胞凋亡產生抑制作用。此外，對T細胞進行體外培養并將ICOS加入后，可見炎癥因子水平上升，且上升量為CD28共刺激時的30.0%～90.0%〔15，16〕。本研究結果表明2型糖尿病患者ICOS/ICOSL正向協同刺激通路存在明顯的活化。本研究結果還表明2型糖尿病患者ICOS/ICOSL升高可能會使CD4+T細胞與T細胞的相互作用增強，導致自身抗體、免疫應答過度產生，進而對組織造成損傷。

在多種自身免疫性疾病中，OX40/OX40L信號通路均有參與，抗OX40L單克隆抗體可對自身反應性T細胞產生選擇性地剔除作用，使自身免疫性疾病患者病情得以緩解〔17〕。OX40L主要于活化的B細胞、巨噬細胞等中表達，抗原提呈表面的OX40L會與T淋巴細胞表面OX40進行結合，提供T細胞活化的信號通路，進而使T淋巴細胞活化，并遷移至炎癥病灶處。此外，OX40/OX40L信號通路可對樹突細胞的分化成熟產生促進作用，而樹突細胞活化后可對T細胞進行激活，使血管內皮細胞受到損傷，并促使炎性細胞因子產生，加劇免疫炎癥反應〔18〕。本研究結果提示在2型糖尿病的致病過程中，OX40/OX40L有所參與。此外，本研究結果提示在自身抗體中OX40/OX40L有重要作用。OX40L會與B細胞、樹突細胞等表明的CD40產生配基化反應，使三聚體形成，并結合相關受體因子，達成信號轉導，使免疫效應細胞活化，進而促進大量共刺激分子表達，對機體特異性免疫應答反應進行誘導與調節。B細胞屬于不成熟狀態的抗原提呈細胞，靜止時對共刺激分子的表達極低，OX40與OX40L產生相互作用時，可促進B細胞活動，促進B淋巴細胞分泌促炎因子。

2型糖尿病患者在病程發展過程中，機體處于高血糖環境下，細胞炎性反應會增加，進而導致患者出現并發癥，如大血管病變〔19〕。ICOS在2型糖尿病患者B細胞、CD4+細胞上的表達與疾病活動程度有關，ICOS水平隨病程的延長而增加，2型糖尿病患者出現大血管病變后，病情加重，免疫功能異常程度提升、炎癥反應增強，ICOS/ICOSL表達水平隨之上升，而ICOS/ICOSL表達水平上升又會進一步加重機體病理性損傷〔20〕。因此，臨床上對2型糖尿病患者實施診治時，可將ICOS/ICOSL表達水平作為一個指標，以對疾病活動度、大血管病變出現的風險進行評估，而采用生物學方法對ICOS/ICOSL的共刺激通路進行阻斷有望成為2型糖尿病的一個治療靶點。OX40/OX40L可為T細胞提供活化的共刺激信號，使T細胞大量增殖，并產生相關細胞因子。同時OX40/OX40L可對Th2這一T輔助細胞因子、IL-17的表達進行調節，對B細胞分化產生作用，進而參與至自身免疫調節中〔21〕。2型糖尿病患者機體在高血糖狀態影響下，會有大量的OX40L產生，并參與血管內皮的炎性反應。膜型OX40L可與T細胞表達的OX40受體直接結合，促進T細胞活化。不僅如此，OX40L還能夠存在可溶性形式，sOX40L與T細胞表面的OX受體結合后，可從血液循環中通過，并與遠端的T細胞表面受體結合，對淋巴細胞產生誘導作用，使其功能活化，使炎性反應加快，并放大已有炎性反應，進而使患者出現大血管病變。可見，在2型糖尿病出現大血管病變的過程中，OX40/OX40L共刺激信號有重要作用，而大血管病變是2型糖尿病患者常見且嚴重的一種并發癥，也是2型糖尿病患者死亡的主要原因，將OX40L當作靶點對2型糖尿病患者進行干預，可為其大血管病變的防治提供新的思路。