地西他濱對老年急性髓細胞白血病患者腫瘤相關巨噬細胞及調節性T淋巴細胞表達的影響

陶石 徐珊琦 焦明秀 陳瑜 符才波 胡敏

(1海南醫學院第一附屬醫院血液內科，海南 海口 570100；2哈爾濱醫科大學附屬第三醫院；3黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院)

急性髓細胞白血病(AML)是成人常見的血液系統惡性疾病之一，其主要治療方式為化療，患者完全緩解率可達60%～70%，中位生存時間接近2年〔1〕。近年來，老年AML患者的比例呈現增高的趨勢，且老年人一般狀況差，造血功能恢復亦明顯減弱，部分患者無法耐受常規化療〔2〕。地西他濱(DAC)屬于去甲基化藥物，適用于強化療不耐受的患者，能顯著改善AML患者的預后，提高生存質量。研究表明，DAC通過去除異常甲基化位點的甲基發揮免疫調節及抗腫瘤作用，但其機制仍未研究明確〔3〕。腫瘤相關巨噬細胞(TAM)是機體重要的抗原呈遞細胞，既往研究發現TAM在腫瘤細胞的存活及耐藥性產生中發揮重要作用〔4〕；調節T淋巴細胞(Tregs)能抑制機體對腫瘤的免疫反應，參與腫瘤細胞的免疫逃逸，并促進腫瘤的進展和轉移〔5〕。本研究通過觀察DAC對老年AML患者TAM及Tregs表達的影響，探討其免疫調節及抗腫瘤機制。

1 資料與方法

1.1一般資料及病例納入標準 選取2016年1月至2019年1月海南醫學院第一附屬醫院收治的96例診斷為AML的老年患者作為研究對象，男51例，女45例，年齡60～75〔平均(67.8±5.9)〕歲。所有患者符合以下標準：①符合AML的診斷標準，并經過骨髓穿刺進行病理學分型；②初發AML患者，既往未接受治療；③自愿參與本次研究并簽署知情同意協議，研究符合醫學倫理學原則。排除：①既往有其他良惡性腫瘤及血液系統疾病；②合并有嚴重的心、腎、肝、肺功能異常，一般狀況較差；③有其他應用化療藥物禁忌證；④合并有急慢性感染；⑤合并有精神神經系統疾病，無法配合治療。

1.2分組及治療方法 所有患者隨機分為觀察組48例，對照組48例，所有患者接受CAG化療〔重組粒細胞集落刺激因子(G-CSF)+阿糖胞苷+阿柔比星〕方案，治療如下：G-CSF(商品名：惠爾血，生產單位：協和發酵麒麟株式會社，批號：20160114)150 μg 每12 h 1次，皮下注射；阿柔比星10 mg/d(商品名：注射用鹽酸阿柔比星，生產單位：深圳萬樂藥業有限公司，批號：20160514)，靜脈滴注，連續應用7～10 d；阿糖胞苷(商品名：賽德威，生產單位：澳大利亞科鼎，批號：20160305)每日10 mg/m2，分2次皮下注射，間隔12 h，連續使用14 d。

觀察組在上述治療的基礎上聯合應用DAC(商品名：晴唯可，生產單位：正大天晴藥業集團股份有限公司，批號：20110704)10 mg/d連用7 d。患者治療以28 d為1個化療周期，持續3個療程。

1.3觀察指標 ①化驗檢查：所有患者于治療前及治療3個療程后接受血常規及血生化檢查，記錄患者的白蛋白(Alb)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、血肌酐(Scr)、白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血小板計數(PLT)及血紅蛋白(Hb)水平。②療效評價：AML治療效果參照《血液病診斷及療效標準(第3版)》〔6〕，記錄兩組1個療程、2個療程及3個療程后完全緩解(CR)/骨髓完全緩解(mCR)率。③腫瘤TAM及Tregs表達水平檢測：所有患者于清晨經靜脈抽取空腹血3 ml，置于加入含有低分子肝素的抗凝管中，離心10 min(速度3 000 r/min)后棄上清，加入單核細胞分離液，以1 500 r/min的速度離心30 min后吸取單核細胞層，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌(500 r/min，離心10 min，棄上清；重復2次)。加入PBS制備單核細胞懸液，細胞濃度為(2～5)×107個/ml，將樣本分裝至1.5 ml凍存管，每份100 μl，保存于-80℃，待檢。TAM檢測采用流式細胞技術，取3管標本，于4℃下融解，分別加入抗體HLA-DR、 CD33FITC、 CD 11bFITC、 CD205PE、 CD4PE、 CD25FITC，充分混勻并置于4℃下避光孵育20 min后加入300 μl PBS，搖勻后進行流式細胞檢測。檢測時在前向側向散射光的二維散射圖形上先確定外周血單個核細胞分布，同時采用酶聯免疫吸附試驗定量檢測血巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-1α水平，血樣本采集方法同上。研究采用MIP-1α及CD206代表TAM表達水平，CD4、CD25代表Tregs表達水平。比較兩組治療前后TAM及Tregs表達水平。④不良反應發生率：常見的不良反應包括骨髓抑制、感染、肝功能受損、腎功能受損及消化道不良反應等。

1.4統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t及χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩組治療前后化驗指標比較 兩組治療前化驗指標無明顯差異(P>0.05)。與治療前相比，兩組治療后Alb、PLT及Hb顯著升高，WBC顯著降低，觀察組RBC較治療前顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組治療后WBC、PLT及Hb比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

組別 Alb(g/L)ALT(U/L)AST(U/L)Scr(μmol/L)WBC(×109/L)RBC(×1012/L)PLT(×109/L)Hb(g/L)觀察組 治療前31.5±4.241.7±5.637.5±3.178.9±11.219.6±3.23.2±0.4114.7±19.584.1±9.8 治療后37.9±2.62)44.1±7.438.9±4.579.3±8.56.7±1.31)2)3.7±0.32)179.6±28.01)2)103.7±12.61)2)對照組 治療前31.8±3.941.5±6.037.1±4.077.8±10.419.2±2.93.2±0.5119.3±20.785.8±9.0 治療后37.1±2.52)43.9±6.839.9±6.978.4±7.68.9±2.12)3.5±0.3148.6±23.32)97.6±10.22)

與對照組治療后比較：1)P<0.05；與本組治療前比較：2)P<0.05，下表同

2.2兩組治療期間CR/mCR比較 觀察組治療第1個療程和第3個療程后的緩解率顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3兩組治療前后TAM及Tregs變化 兩組治療前TAM及Tregs的差異無統計學意義(P>0.05)。與治療前比較，觀察組治療后MIP-1α、CD206+細胞比例及Tregs細胞比例均明顯降低(P<0.05)，對照組治療后MIP-1α無明顯變化(P>0.05)，CD206+細胞比例及Tregs細胞比例明顯降低，且上述指標的組間差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 兩組治療期間CR/mCR比較〔n(%),n=48〕

表3 兩組治療前后TAM及Tregs比較

2.4兩組治療期間不良反應的發生情況 兩組治療過程中均未出現嚴重的不良反應，且在對癥治療或停藥后均明顯好轉。兩組不良反應發生率差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩組不良反應發生率比較(n，n=48)

3 討 論

隨著表觀遺傳學的發展，基因及蛋白質的修飾對于致病基因作用及疾病發生的影響逐漸引起臨床上的關注。既往研究發現與核酸甲基化相關DNA甲基轉移酶及轉移酶同源序列增強子(EZH)突變與腫瘤發生密切相關，抑癌基因或促癌基因啟動子區域或調節元件的高度甲基化更是AML發生的重要機制〔7，8〕。因此，抑制基因異常甲基化對于提高AML患者的緩解率，改善患者預后具有重要意義。

本研究結果說明DAC能夠有效促進AML患者的恢復。DAC是一種新型的去甲基化抗腫瘤藥物，能夠通過細胞膜表面轉運蛋白進入細胞內，并活化后進入DNA，能顯著提高因為異常甲基化而沉默的抑癌基因活性，發揮抗腫瘤作用〔9〕。且DAC具有副作用小，安全性高的優點，因此DAC已經成為不能耐受強效化療的AML患者的首選治療藥物之一〔10〕。

DAC具有多重免疫調節作用：包括增強腫瘤細胞的免疫原性及清除抑制免疫抑制細胞等。研究證明DAC能夠通過去除腫瘤抗原表達調控元件部分的甲基化，促進腫瘤特異性抗原的表達，并誘導細胞毒性T細胞及自然殺傷細胞激活，增強機體免疫系統對于腫瘤的清除作用〔11，12〕。

髓系抑制性細胞能夠通過分泌細胞因子及促進程序性細胞凋亡受體表達抑制細胞毒性T細胞的表達，并誘導Tregs的分化，發揮免疫抑制作用。而低劑量的DAC能夠誘導髓系抑制性細胞的凋亡，打破細胞形成的腫瘤免疫逃逸微環境，延緩AML小鼠的生存期〔13〕。本研究中，應用DAC患者Tregs的下降幅度明顯高于單用CAG的患者，說明DAC能夠有效抑制Tregs的表達，改善腫瘤患者的免疫抑制。

巨噬細胞是機體免疫系統的重要組成部分，具有抗感染及抗腫瘤等多種免疫作用，但巨噬細胞具有可塑性強的特點，其分化過程(又稱極化)受多重因素的調節。巨噬細胞可分化為M1及M2兩大亞群，分別有抗腫瘤及促進腫瘤的作用。既往研究發現，惡性腫瘤患者的巨噬細胞可被極化成為有促進腫瘤作用的特殊類型M2細胞，即TAM〔14，15〕。

TAM的產生參與腫瘤組織免疫抑制微環境的形成。既往研究發現，腫瘤微環境中含有大量未成熟的樹突細胞及Tregs，上述細胞能否通過分泌免疫抑制性的細胞因子如白細胞介素-10等，促進腫瘤的免疫逃逸，并誘導TAM形成；同時，TAM能進一步活化Tregs及低活性的呈遞作用來促進機體免疫系統對腫瘤的適應作用，促進腫瘤生產〔16〕。TAM亦能通過表達血管內皮生長因子及腫瘤來源的趨化因子促進惡性腫瘤的轉移〔17〕。但目前TAM的形成機制仍未研究明確。

既往研究發現NOD樣受體家族成員NLRC5(由氨基酸的CARD樣區域、中間的NOD樣區和羧基端的亮氨酸重復序列區域三部分組成)對巨噬細胞炎癥因子分泌有著重要調控的作用。NLRC5啟動子區域過度甲基化導致基因表達水平下調，M1活性下降；而給予甲基化抑制劑后M1形成明顯增加，M2水平下降〔18〕。本研究中，與單獨應用CAG的患者相比，聯合應用DAC的患者治療后TAM含量及其標記蛋白明顯下降。DAC可能通過去除NOD樣受體分子NLRC5啟動子甲基化抑制TAM的表達水平。綜上所述，DAC能夠有效抑制老年AML患者TAM及Tregs的表達發揮免疫調節作用，提高患者緩解率。