血管性認(rèn)知功能障礙大鼠膽堿酯酶及膽堿乙酰化酶的表達(dá)

任家謀 高玉梅 吳昌學(xué) 李毅 王凡

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3貴陽市第四人民醫(yī)院；4貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

血管性認(rèn)知障礙(VCI)的定義最早由Hachinski和Bowler在1993年提出〔1〕。VCI是指由血管性危險(xiǎn)因素相關(guān)的各種腦血管病引起的從輕度認(rèn)知障礙到癡呆的臨床綜合征〔2〕。近年來，由血管性因素導(dǎo)致的癡呆及認(rèn)知功能障礙的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響了中老年人群的健康和生活質(zhì)量，并且目前還未尋找到能有效治療VCI的藥物，所以研究 VCI 發(fā)生機(jī)制及人群易感因素對防治 VCI 及防止其發(fā)展為癡呆具有重要意義〔3〕。乙酰膽堿(Ach) 作為大腦組織中重要的一種神經(jīng)遞質(zhì)，是記憶形成的必需神經(jīng)遞質(zhì)和長期記憶的生理基礎(chǔ)，ACh 的作用機(jī)制是通過腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激動系統(tǒng)來維持大腦的覺醒狀態(tài)，Ach在大腦皮層及海馬的缺失將會引起空間認(rèn)知和記憶障礙〔4〕，造成腦功能紊亂。VCI 時(shí)中樞膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)受體及其功能可能受損，從而引起認(rèn)知功能的損害。

為了更加明確地了解膽堿能系統(tǒng)及在VCI 發(fā)病機(jī)制中的作用，采用四血管閉塞法(4-VO) 建立實(shí)驗(yàn)動物模型，以獲得輕度認(rèn)知障礙的大鼠癡呆模型〔5〕，本文分析VCI大鼠大腦皮層膽堿能系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶(AChE)、膽堿乙酰化酶(ChAT)及其檢測相關(guān)mRNA的表達(dá)。

1 材料及方法

1.1材料 選用SD大鼠100只，8月齡，體重300～400 g，雌雄各半，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，EnVision二步法試劑盒購自Dako公司，二甲基聯(lián)苯胺(DAB)購自北京中杉金橋生物制劑有限公司，Trizol、鼠抗AChE、ChAT、β-actin單克隆抗體及普通化學(xué)試劑和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠二抗購自美國Sigma公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑、高效顯影膠片購自Amersham公司，組織裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)試劑盒購于碧云天生物試劑公司，顯影液、定影液購于柯達(dá)公司，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量測試盒購于南京建成公司。

1.2動物篩選 飼養(yǎng)1 w后的SD大鼠，將其進(jìn)行Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行初步篩選，淘汰掉學(xué)習(xí)能力較強(qiáng)的(逃避潛伏期≤15 s)和學(xué)習(xí)能力極差的SD大鼠(逃避潛伏期≥60 s)，留下學(xué)習(xí)能力、記憶水平相當(dāng)?shù)腟D大鼠72只，對其進(jìn)行隨機(jī)分組：模型組與假手術(shù)組，在進(jìn)一步對其進(jìn)行細(xì)分為造模2 w組，1個(gè)月組和3個(gè)月組，每組12只。

1.3模型復(fù)制 將實(shí)驗(yàn)大鼠用10%的水合氯醛，0.5 ml/100 g體重，腹腔麻醉。另在腹腔注射125 U肝素-生理鹽水/ml，100 U/100 g。將大鼠仰臥，頭頂部正中切開，將三棱針在中線旁和右冠狀縫后各1 mm處穿透至骨膜外，安不銹鋼電極接腦電地形圖儀負(fù)極。在背側(cè)頸部，正中切口，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔，用直徑為0.5 mm的電凝針，插入雙側(cè)翼小孔燒灼雙側(cè)椎動脈，造成永久性閉塞。翻轉(zhuǎn)動物成仰臥位，頸正中切開，氣管切開置管接小動物呼吸機(jī)控制呼吸。在鎖骨上緣附近，分離雙側(cè)頸總動脈，穿線備用放回籠中。24 h后用無創(chuàng)微動脈夾同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min，造成持續(xù)的全腦缺血，松開動脈夾給予血液再灌注，間隔1 h，重復(fù)3次。然后縫合傷口，分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組只分離椎動脈和頸總動脈，不作凝閉和夾閉。

缺血模型的可靠性基于缺血?jiǎng)游矬w征表現(xiàn)，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒定大鼠腦缺血模型：大鼠在缺血前完全清醒，生命體征正常，4-VO 法引起腦缺血后 30～60 s大鼠的知覺和活動能力即失去，痛覺消失，翻正反射消失，出現(xiàn)角弓反張，出現(xiàn)雙側(cè)瞳孔散大，眼球顏色由正常的鮮紅色變?yōu)榛野咨缓笤俟嘧⒑蟠笫笱矍蝾伾椿謴?fù)為紅色，散大的瞳孔回縮，缺血5 min需再灌注約1 h后大鼠才能恢復(fù)自主活動。

1.4學(xué)習(xí)記憶能力測定 Morris水迷宮的行為測試在造模后2 w，1個(gè)月和3個(gè)月進(jìn)行，以觀察游泳，定向?qū)Ш胶涂臻g探索實(shí)驗(yàn)的結(jié)果學(xué)習(xí)和記憶技能的變化。

1.5腦組織病理學(xué)檢查 取右側(cè)大腦半球正矢狀面(包括海馬)，10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋和切片，蘇木素-伊紅(HE)染色和尼氏染色(Olszwski焦油紫染色法)。

1.6AChE及ChAT活性測定 分別于造模2 w、1個(gè)月、3個(gè)月后股動脈取血，乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝，離心取血漿檢測；動物斷頭處死，冰盤上快速剖取海馬組織，按組織重量體積比為1∶9加預(yù)冷的生理鹽水制成10% 的組織勻漿；ChAT的測定以乙酰輔酶A和膽堿為底物，在ChAT的作用下，反應(yīng)的生成物和顯色劑結(jié)合，在324 nm處測定吸光度，計(jì)算ChAT的活力。按試劑盒說明書進(jìn)行血漿酶活力測定。設(shè)定在pH7.2條件下，37℃時(shí)每毫升血清每分鐘轉(zhuǎn)移1 μmol乙酰基給膽堿的能力定義為一個(gè)酶活力單位。AChE 酶活性測定：血液中 AChE 能使ACh水解成膽酸和乙酸，未被分解的剩余ACh與羥胺作用生成乙酰羥胺，再與鐵離子在酸性溶液中形成棕色復(fù)合物，在 520 nm處測定吸光度，按公式計(jì)算出酶的活力。實(shí)驗(yàn)按試劑盒說明書進(jìn)行。將每毫升血清在37℃和底物作用20 min，分解1 μmol乙酰膽堿為1個(gè)活力單位。

1.7AChE，ChAT的蛋白表達(dá) 采用Western印跡法檢測，將海馬組織在玻璃勻漿器中勻漿并加入預(yù)冰冷的5 ml緩沖液A(50 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、pH7.40，10% trixton-100)及苯甲基磺酰氟(PMSF)和復(fù)合蛋白酶抑制劑，在冰上制成腦組織勻漿并置于冰上1 h以充分裂解腦組織細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)制備細(xì)胞勻漿，并在4℃、12 000 r/min，離心40 min，棄去沉淀物，用考馬斯亮藍(lán)法對提取的上清液進(jìn)行蛋白定量。用Western印跡法檢測假手術(shù)組和模型組AChE、ChAT蛋白表達(dá)，然后使用掃描儀掃描曝光膠片并用Bandscan軟件分析結(jié)果進(jìn)一步探索VCI中膽堿能受體系統(tǒng)的兩種酶的變化趨勢，確定變化在臨床診斷和治療中的作用。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD對方差齊性做進(jìn)一步的兩兩比較，DunnettT3對方差不齊做兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)改變 造模后2 w,與假手術(shù)組比較，模型組毛色發(fā)黃、粗糙，活動及飲食減少。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期稍有延長但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，空間探索試驗(yàn)也無明顯差異。造模1個(gè)月后，與假手術(shù)組比較，模型組平均逃避潛伏期顯著延長(P<0.01)；平臺撤去后，將在原第Ⅳ象限平臺的活動時(shí)間作為指標(biāo)，與假手術(shù)組比較，模型組首次穿越平臺所需時(shí)間明顯延長(P<0.01)，穿越站臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)。假手術(shù)組游泳方式以繞平臺游泳和穿梭游泳為主，模型組以環(huán)池游泳和穿梭游泳為主，通過結(jié)果說明模型組明顯出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶障礙。造模3個(gè)月后與假手術(shù)組比較，模型組平均逃避潛伏期仍顯著延長(P<0.01)；首次穿越平臺所需時(shí)間明顯延長及次數(shù)明顯減少(P<0.01，P<0.05)。模型組學(xué)習(xí)、記憶障礙持續(xù)發(fā)生，且無恢復(fù)的趨勢。見表1、表2。

組別造模2 w第1天第2天第3天第4天假手術(shù)組56.52±3.7441.73±15.1121.67±13.6117.58±10.23模型組55.55±6.3145.56±15.9331.84±18.2924.28±15.04組別造模1個(gè)月第1天第2天第3天第4天假手術(shù)組16.05±13.0211.65±11.939.73±4.958.50±5.45 模型組51.05±17.201)34.00±22.141)16.04±12.341)13.87±11.261)組別造模3個(gè)月第1天第2天第3天第4天假手術(shù)組39.29±22.8419.74±17.1717.86±14.9816.55±16.07模型組50.36±17.851)49.00±17.281)49.90±17.451)43.43±20.931)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；下表同

組別造模2 w大鼠第1次穿越平臺所需時(shí)間(s)平臺穿越次數(shù)(次)造模1個(gè)月大鼠第1次穿越平臺所需時(shí)間(s)平臺穿越次數(shù)(次)造模3個(gè)月大鼠第1次穿越平臺所需時(shí)間(s)平臺穿越次數(shù)(次)假手術(shù)組19.33±13.282.75±1.598.05±6.453.50±2.1214.58±13.793.18±2.11模型組21.47±6.482.58±0.5822.93±17.901)2.08±1.462)32.97±19.911)1.17±1.071)

2.2病理形態(tài)學(xué)改變 HE染色可見各時(shí)間段假手術(shù)組海馬各區(qū)細(xì)胞層次清楚，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)清晰完整，CA2區(qū)錐體細(xì)胞排列規(guī)則、緊湊，形態(tài)完整，膠質(zhì)細(xì)胞呈散在分布，未發(fā)現(xiàn)明顯神經(jīng)元損傷；造模2 w模型組僅見神經(jīng)元丟失；造模1個(gè)月模型組海馬CA2區(qū)錐體細(xì)胞帶不完整、排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，少數(shù)神經(jīng)元呈片狀或點(diǎn)狀，嗜伊紅染色增強(qiáng)，似紅色神經(jīng)元，細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組無明顯減少；造模3個(gè)月模型組海馬CA2區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，部分?jǐn)?shù)神經(jīng)元呈片狀或點(diǎn)狀，嗜伊紅染色增強(qiáng)，似紅色神經(jīng)元(圖1)。尼氏染色顯示假手術(shù)組海馬各區(qū)錐體細(xì)胞胞質(zhì)中布滿著深紫色呈顆粒狀的尼氏小體，著色較深而均勻一致；與假手術(shù)組相比，造模2 w模型組未見明顯變化，造模1個(gè)月與3個(gè)月模型組腦海馬錐體細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)尼氏體減少，染色減弱，部分錐體細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)尼氏體溶解，輪廓模糊、著色淺淡，造模3個(gè)月模型組較1個(gè)月改變更為明顯。見圖2。

2.3海馬組織 AChE、ChAT 蛋白表達(dá) 免疫組化檢測結(jié)果顯示，隨著造模時(shí)間的延長，AChE的表達(dá)逐漸增加，以海馬神經(jīng)元胞質(zhì)及突起為主要表達(dá)部位，強(qiáng)陽性表達(dá)的部位為CA4、CA3、CA2，CA1區(qū)陽性表達(dá)較弱，模型組與假手術(shù)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著造模時(shí)間的延長，ChAT的表達(dá)逐漸降低，造模3個(gè)月模型組海馬神經(jīng)元呈陰性，模型組與假手術(shù)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、表3、圖4)。

圖1 各組海馬CA2區(qū)病理變化(HE，×100)

圖2 各組海馬CA1區(qū)尼氏染色(×100)

圖3 各組腦海馬組織CA3區(qū)AChE表達(dá)(免疫組化，×100)

表3 各組海馬CA3區(qū)AChE、ChAT的積分光密度值

2.4海馬組織及血漿AChE及ChAT酶活性測定 造模2 w模型組血漿AChE活性出現(xiàn)降低趨勢，但與假手術(shù)組差異無顯著性，但隨著造模時(shí)間延長，降低程度更明顯；海馬組織中造模2 w模型組AChE活性升高，升高程度與造模時(shí)間呈正比。造模2 w模型組血漿ChAT活性即明顯升高，隨著造模時(shí)間延長，血漿ChAT活性升高，且隨著造模時(shí)間延長，升高程度更加明顯；而在海馬組織中ChAT活性的下降，下降程度與造模時(shí)間呈正比。見表4。

圖4 各組腦海馬組織CA3區(qū)ChAT表達(dá)(免疫組化，×100)

組別血漿AChE海馬AChE海馬ChAT血漿ChAT2 w假手術(shù)組30.21±2.9172.21±3.7129.13±1.8181.23±2.732 w模型組28.14±2.3278.31±3.811)27.21±3.711)95.23±2.832)1個(gè)月假手術(shù)組31.23±2.4075.21±5.7126.14±4.5180.24±3.421個(gè)月模型組21.34±1.801)88.23±7.611)20.32±2.911)96.03±5.621)3個(gè)月假手術(shù)組30.13±3.9080.12±8.3126.18±2.9185.12±6.423個(gè)月模型組19.21±1.501)91.13±9.411)19.29±2.911)97.13±7.821)

2.5AChE及ChAT蛋白表達(dá)水平 模型組海馬組織 AChE 蛋白水平顯著升高，且隨時(shí)間延長升高更為明顯。ChAT 蛋白水平明顯下降，且其下降趨勢隨時(shí)間的延長表現(xiàn)更加顯著，與假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5，表5。

圖5 各組海馬中AChE 及 ChAT 蛋白表達(dá)

表5 各組海馬組織AchE和ChAT蛋白表達(dá)

3 討 論

ACh是腦組織中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，是由膽堿和乙酰輔酶A在ChAT的催化下生成，ACh在體內(nèi)能夠迅速地被AChE降解，ACh是記憶形成的必需神經(jīng)遞質(zhì)和長期記憶的生理基礎(chǔ)，ACh 經(jīng)突觸間隙與突觸后膜的膽堿能受體結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)作用〔6〕。認(rèn)知功能障礙患者的腦組織中 ChAT 及 AChE 活性的損害最終引起Ach合成、釋放、攝取等功能降低，引起大腦功能紊亂〔7〕。

VCI鼠在出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶障礙，且出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞損傷及尼氏小體的丟失，說明造模成功〔8，9〕。VCI患者血漿AChE 和ChAT活性的變化主要與梗死部位和容積有關(guān)。

VCI鼠海馬組織中的AChE 表達(dá)升高增加了Ach的降解，ChAT 表達(dá)下降導(dǎo)致其合成減少，從而影響了大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力；通過免疫組化檢測結(jié)果顯示，隨造模時(shí)間的延長AChE表達(dá)逐漸升高，海馬神經(jīng)元胞質(zhì)及突起為陽性表達(dá)的主要部位，其中陽性表達(dá)較強(qiáng)的部位為CA4、CA3、CA2區(qū)，CA1區(qū)陽性表達(dá)較弱，隨造模時(shí)間的延長ChAT表達(dá)逐漸降低。綜上，AChE 與 ChAT 的變化是血管因素引起的認(rèn)知功能障礙中較早出現(xiàn)的特異性改變，與認(rèn)知功能障礙的程度密切相關(guān)。