健蕊康中水煎劑對阿爾茨海默病小鼠β-淀粉樣蛋白和閉鎖小帶蛋白表達的影響

張英華 費洪新 張曉杰，3 (新鄉醫學院，河南 新鄉 453003；廣西科技大學;3齊齊哈爾醫學院)

阿爾茨海默病(AD)是一種常見的慢性神經退行性疾病〔1,2〕。目前，AD發病機制尚不清楚，β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積是致病因素之一〔3,4〕。近年來，一些學者認為腦血管功能發生障礙會導致Aβ無法有效通過血腦屏障從中樞神經系統中清除，積聚在腦血管和腦實質中〔5〕。血管內皮細胞間緊密連接(TJ)是血腦屏障重要結構，閉鎖小帶蛋白(ZO)-1是TJ重要成分〔6〕，上調ZO-1表達有助于保護血腦屏障，降低腦內Aβ聚積，改善AD癥狀〔7〕。目前，關于AD的治療臨床上多采用西藥治療，如膽堿酯酶抑制劑等〔8,9〕、抗氧化劑〔10,11〕。但是西藥在治療疾病的同時有明顯副作用，由此研究副作用相對較小且綜合治療效果較好的中藥復方制劑是目前需研究的方向。本實驗通過觀察健蕊康中水煎劑(JKD)對AD小鼠海馬Aβ和ZO-1的影響，進一步探討JKD治療AD的相關機制。

1 材料與方法

1.1動物及儀器 動物：清潔級3月齡淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素(PS)1雙轉基因小鼠，雄性，24只，體質量(27±2)g，對照組小鼠選用同窩陰性雄鼠(8只)。小鼠均購買于南京大學生物醫藥研究院(SCXK(蘇)2015-0001)，動物常規飼養于齊齊哈爾醫學院動物實驗中心。儀器：RM213型切片機(Leica公司)，BMJ-1B型組織包埋機(上海寰熙醫療器械有限公司)，HH-11420-BS型電熱恒溫培養箱(上海五久自動化設備有限公司)，DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器(北京慧龍環科環境儀器有限公司)，HT7700型透射電子顯微鏡(日立公司)等。

1.2藥物與試劑 藥物：JKD(商標申請號：33678269)包括黃芪40 g(產品批號1712068S)，當歸尾6 g(產品批號170501)，赤芍5 g(產品批號1704055S)，水紅花子20 g(產品批號175120)共71 g，購買于齊齊哈爾市中醫院，于齊齊哈爾醫學院藥學院經過浸泡，煎煮，過濾，蒸發等制備成水煎劑，保存于4℃冰箱，灌胃前混勻加熱。試劑：鹽酸多奈哌齊(陜西方舟制藥公司，批號H20030583)；Aβ抗體(ab201060)和GAPDH抗體(ab9485)購于Abcam公司；抗體ZO-1(PB9234)和PBS(AR030)購于武漢博士德；改良檸檬酸鈉抗原修復液(YB0303)購于上海鈺博生物科技等。

1.3模型分組及給藥 將APP/PS1雙轉基因小鼠隨機法分為多奈哌齊組、JKD組、模型組。模型組和對照組小鼠給予0.3 ml生理鹽水灌胃，多奈哌齊組給予0.001 g/kg鹽酸多奈哌齊片灌胃，JKD組給予9.23 g/kg JKD灌胃。連續灌胃給藥35 d。

1.4學習能力檢測 參考文獻〔12〕檢測學習記憶能力。圓形水池內倒入自來水約高20 cm，再向水池內倒入溫水泡好的奶粉攪拌均勻，使水池內形成均勻白色背景，將平臺安裝于第4象限，使其低于水面下0.5～1.0 cm，水池內水溫設定在(22±1)℃。前4 d為訓練時間，將池劃分為4個象限，每天不同的隨機象限入水，每次訓練60 s。如果小鼠在60 s內站到平臺不足10 s，則需將其引到平臺上10 s。第5天檢測小鼠找到平臺時間為潛伏期，通過潛伏期長短評價小鼠學習能力。

1.5記憶能力檢測 小鼠前4 d訓練同1.4，在第5天時撤去平臺，將小鼠在相同位置放入水池自由游泳60 s，記錄小鼠找到平臺撤去前隱藏位置的游泳距離，通過距離長短評價小鼠記憶能力。

1.6學習記憶保持能力檢測 實驗同1.4，第5天撤去平臺，計算機記錄小鼠在目標平臺交叉的次數(跨平臺次數)，通過跨平臺次數多少評價學習記憶保持能力。

1.7透射電子顯微鏡觀察 行為學完成后，冰上迅速取小鼠海馬，依次戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液沖洗，鋨酸固定，脫水，滲透等制成切片后觀察血管內皮細胞及TJ。

1.8免疫組織化學(IHC)檢測 冰上迅速取小鼠腦組織，制成石蠟切片，按照試劑盒說明書操作，切片經過脫蠟復水，微波修復，過氧化氫(H2O2)處理，封閉，一抗(4℃過夜)，二抗反應，化學染色使用工作液，顯微鏡下觀察，流水沖洗10 min，復染，脫水封片后觀察，Image-ProPlus6.0軟件算出海馬Aβ和ZO-1平均光密度值(MOD)。

1.9RT-qPCR檢測 小鼠海馬組織80 mg，加入800 μl Trizol，按說明書進行海馬總RNA抽提。總RNA純度檢測后將其逆轉錄合成cDNA，然后PCR擴增。各引物的序列設計如下表：GAPDH(上游：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′；下游：3′-CCACAGGATTCCATACCCAA-5′)；Aβ(上游：5′-TGTGCGACAAGGTGCAGAAA-3′；下游：3′-ACAATGGCCACTTGCCGAT-5′)；ZO-1(上游：5′-AGCTGCCTCGAACCTCTACTCTAC-3′；下游：3′-GCCTGGTGGTGGAACTTGCTC-5′)。引物由上海生工有限公司合成。所得實驗數據采用2-△△Ct法計算海馬Aβ和ZO-1基因相對表達量。

1.10統計學分析 采用SPSS22.0 軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.14組學習記憶能力比較 與對照組比較，模型組潛伏期明顯延長，游泳距離明顯增加，跨平臺次數明顯減少(均P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組和JKD組潛伏期明顯縮短，游泳距離明顯減少，跨平臺次數明顯增加(均P<0.05)，見表1。

表1 JKD對AD小鼠學習記憶能力的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.24組TJ比較 對照組小鼠腦組織海馬血管內皮細胞及TJ處結構正常；模型組小鼠腦組織海馬血管內皮細胞核固縮，胞質不豐富，細胞器變性，TJ模糊不清，表明模型組小鼠血管內皮細胞及TJ結構異常；多奈哌齊組和JKD組與模型組相比較，腦組織海馬血管內皮細胞核固縮減輕，胞質相對豐富，細胞器變性減少，TJ清晰可見。見圖1。

圖1 JKD對AD小鼠TJ的影響(透射電子顯微鏡，×62 000)

2.34組Aβ和ZO-1表達比較 與對照組相比，模型組Aβ MOD值明顯升高(P<0.05)，ZO-1 MOD值明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組和JKD組海馬Aβ MOD值均明顯降低(P<0.05)，ZO-1 MOD值明顯升高(P<0.05)，見表 2，見圖2，圖3。

2.44組Aβ 、ZO-1基因表達比較 與對照組相比，模型組AD海馬ZO-1 mRNA相對表達水平明顯降低，海馬Aβ mRNA相對表達水平明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組和JKD組ZO-1 mRNA相對表達量明顯升高，Aβ mRNA相對表達量明顯降低(均P<0.05)，見表3。

表2 4組Aβ 和ZO-1表達比較

圖2 JKD對AD小鼠海馬Aβ 表達的影響(IHC，×400)

圖3 JKD對AD小鼠ZO-1表達的影響(IHC，×400)

表3 4組Aβ mRNA和ZO-1 mRNA表達比較

3 討 論

近年來，隨著醫學界對AD發病機制的深入研究，關于神經血管單元的相關內容逐漸與AD聯系起來。神經血管單元是由神經元，膠質細胞，血腦屏障等構成〔13〕。AD的神經血管假說認為，神經血管單元的任一成分異常都可能導致其功能障礙，而由ZO-1〔14,15〕和跨膜蛋白等構成的TJ蛋白復合體出現結構異常時，神經血管單元的結構和功能也會發生異常。也有相關研究表明，當ZO-1表達降低時，TJ結構被破壞，血腦屏障通透性發生障礙，Aβ在腦內積聚增多，導致AD的發生發展。因此上調ZO-1與降低Aβ和改善AD密切相關。

本研究結果說明JKD對AD小鼠的學習記憶能力有改善作用。JKD可通過抑制Aβ 水平，提高ZO-1水平，從而改善TJ結構，恢復血腦屏障的基本功能，保護腦組織，這在AD治療中發揮積極作用。