海紅果多糖對D半乳糖衰老模型小鼠骨髓端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的影響

姜愛雯 杜佩珊 劉云寧 張鶴鳴

(1河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000；2張家口市第一醫(yī)院)

海紅果是薔薇科蘋果屬楸子的果實，又名海紅、海棠果〔1,2〕，主要分布在晉、陜、蒙三省(區(qū))交界處，是我國西北地區(qū)特有的一種果樹。海紅果營養(yǎng)豐富，具有醒腦提神、去膩除腥的功效〔3,4〕，經(jīng)常食用可健胃消食，增強食欲，軟化血管抗衰老。近年來，海紅果多糖(PFM)的提取工藝〔5〕及藥用價值也逐步被重視，但PFM的研究遠滯后于山楂、香菇、沙棘等〔6～8〕植物類活性成分研究。本文采用實時定量RT-PCR法測定衰老模型小鼠骨髓端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的表達，研究PFM對小鼠的抑制作用。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑及儀器 海紅果購于內(nèi)蒙古呼和浩特市清水河縣；新鮮成熟海紅果洗凈、切片、60℃干燥后粉碎備用；黃芪多糖購于北京索萊寶科技有限公司；D-半乳糖購于北京索萊寶科技有限公司；RNaseA試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒購于上海浩然生物技術(shù)有限公司，其他化學試劑均為分析純；MX 3000P熒光定量PCR儀由美國安捷倫提供。

1.2實驗動物 健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重(24±2)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號:SCXK(京)2014-0004。分為正常組，模型組，PFM低、中、高劑量組，黃芪多糖組各10只。

1.3小鼠骨髓中提取RNA 各組動物處死后，立即取新鮮骨髓，骨髓取出后加入1 ml裂解液RZ，迅速放入液氮保存，按下列步驟提取RNA。(1)組織用勻漿儀進行勻漿處理后，將樣品在15～30℃放置7 min，使得核酸蛋白復合物完全分離。4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清，轉(zhuǎn)入一個新的無RNaseA的離心管中。(2)加入200 μl氯仿，蓋好蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min。(3)4℃、12 000 r/min離心10 min，樣品分黃色有機相、中間層和無色的水相3層，RNA主要在水相中，水相的體積約為所用裂解液RZ試劑的50%。把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進行下一步。(4)緩慢加入0.5倍體積無水乙醇，混勻。將得到溶液沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，4℃、12 000 r/min離心60 s，若一次不能將全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，則分2次轉(zhuǎn)入，4℃、12 000 r/min離心60 s，棄掉收集管中廢液。(5)向吸附柱CR3中加入500 μl去蛋白液RD，4℃、12 000 r/min離心60 s，棄廢液。(6)向吸附柱CR3中加入700 μl漂洗液RW，室溫放置2 min，4℃、12 000 r/min離心60 s，棄廢液。(7)向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW，室溫放置2 min，4℃、12 000 r/min離心30 s，去除殘余液體。(8)將吸附柱放入2 ml收集管中，4℃、12 000 r/min離心2 min，去除殘余液體。(9)將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加30 μl RNase-free ddH2O，室溫放置2 min，4℃、12 000 r/min離心2 min。經(jīng)微量紫外分光光度計檢測總RNA樣品OD值在2.0～2.2之間，提取RNA樣品予-80℃保存。

1.4骨髓RNA反轉(zhuǎn)錄 總RNA 3.76 μl，Anchored Oligo(dT)18 1 μl，Random Primer(N9) 1 μl，2×ES Reaction Mix 10 μl，EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μl，Rnase-free水20 μl。反轉(zhuǎn)錄條件：25℃，10 min；42℃，30 min；85℃，5 min。得到的cDNA樣品于-20℃保存待測。

1.5實時熒光定量PCR測定TERT引物的設(shè)計 待測基因TERT：上游引物5′-ggTTgCCCAATgCCTAgTgTg-3′，下游引物5′-CTCTggCCTCgTTAAgCAgCTC-3′參比基因GAPDH：上游引物5′-TgTgTCCgTCgTCgTggATCTgA-3′下游引物5′-TTgCTgTTgAAgTCgCAggAg-3′。引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物濃度為10 μmol/L。

1.6實時熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件 上游引物(10 μmol/L) 0.4 μl，下游引物(10 μmol/L)0.4 μl，2×TransStartTMTop Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，cDNA 2 μl，Rnase-free水20 μl。混勻后擴增。擴增條件為：95℃ 2 min 預變性，然后95℃ 2 s，58℃ 20 s，40個循環(huán)。應(yīng)用MX 3000P熒光定量PCR儀進行檢測、記錄和分析。

1.7標準曲線制備 用實時定量PCR儀擴增任意一份待測樣品，以10倍梯度稀釋模板的實驗數(shù)據(jù)作標準曲線，共5個濃度，每個稀釋樣品重復3次。

1.8測定樣品數(shù)據(jù)的計算方法 稀釋10倍后的待測樣品cDNA取1 μl加入實時熒光定量PCR反應(yīng)體系中，每份樣品分別測定TERT基因及GAPDH基因的Ct值，重復3次，取平均值。以2-△△Ct計算各組相對值。

1.9統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1端粒酶和GAPDH基因的標準曲線 樣品梯度稀釋后和TERT引物擴增所得到得標準曲線r2=0.992，斜率=-3.177，GAPDH基因擴增后得到的標準曲線r2=1.000斜率=-3.179。說明線性關(guān)系良好，擴增效率高。基因線性關(guān)系和熔點曲線見圖1。

圖1 TERT及GAPDH基因曲線圖

2.2基因測序結(jié)果 將電泳條帶膠用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒回收，送大連寶生物公司測序，將測得序列與經(jīng)GenBank上的BLAST比對分析，與理論序列完全一致。

2.3實時熒光定量PCR結(jié)果分析 與正常組(1.019±0.073)相比，模型組TERT mRNA表達(0.445±0.103)明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，PFM低、中、高劑量組和黃芪多糖組(0.810±0.160、0.817±0.014、1.382±0.011、1.180±0.012)顯著增加(P<0.01)。

3 討 論

實時定量熒光PCR方法是近年來出現(xiàn)的一種新型PCR檢測技術(shù),不僅避免了PCR后操作,而且實現(xiàn)了準確定量。將該技術(shù)用于端粒酶檢測，使端粒重復擴增程序(TRAP)法大大簡化,檢測重現(xiàn)性和定量范圍都得以明顯提高。實時熒光PCR已在基礎(chǔ)研究和臨床診斷方面被廣泛用于核酸定量〔9〕。

近年來研究表明端粒酶可以加速骨髓干細胞骨鈣再生，將TERT轉(zhuǎn)錄調(diào)控至骨髓基質(zhì)細胞，可修復損傷的DNA使端粒長度增加〔10,11〕。說明端粒酶活性降低或缺乏都可能使端粒縮短，從而紊亂細胞內(nèi)環(huán)境使有機生物體衰老〔12〕。本實驗表明PFM通過增加TERT的表達，產(chǎn)生生物體抗衰老的機制。