茶葉微生物固態發酵中咖啡堿降解途徑初探

鄭城欽，馬存強,2，張正艷，李肖宏，吳婷婷，周斌星*

茶葉微生物固態發酵中咖啡堿降解途徑初探

鄭城欽1，馬存強1,2，張正艷1，李肖宏1，吳婷婷1，周斌星1*

1. 云南農業大學龍潤普洱茶學院，云南 昆明 650201；2. 昆明大樸茶業有限公司，云南 昆明 650224

為探究微生物作用下咖啡堿的降解產物與途徑，將普洱茶發酵中篩選鑒定的NRRL250（聚多曲霉）、NRRL4789CBS137324和CBS253.31等優勢菌株分別接種至曬青毛茶進行單菌種固態發酵，并采用高效液相色譜（HPLC）測定咖啡堿、可可堿、茶堿的含量，探究微生物對咖啡堿代謝的影響；另外，基于UHPLC-QTOF-MS代謝組學技術，以滅菌處理組（ST組）和原料組（RM組）為對照，對聚多曲霉接種發酵樣進行代謝組學分析。結果表明，NRRL4789CBS137324和CBS253.31等優勢菌株對咖啡堿等嘌呤類堿代謝均無顯著影響，而在聚多曲霉接種發酵中，咖啡堿含量顯著下降（＜0.05），降幅達83.89%；茶堿含量顯著增加（＜0.05），發酵末期含量為(25.03±1.17)?mg·g-1；而可可堿保持基本穩定。由此可知，聚多曲霉對咖啡堿降解代謝有顯著影響。采用UHPLC-QTOF-MS方法檢出茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤等9種與咖啡堿降解相關的代謝物。在聚多曲霉作用下，茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤含量顯著提高（＜0.05）。茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤和1-甲基黃嘌呤與咖啡堿及其相關代謝物的-脫甲基化途徑相關。1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸與咖啡堿相關代謝物的氧化途徑相關。由此可知，聚多曲霉為降解普洱茶咖啡堿的優勢菌株，且具有將咖啡堿轉化為茶堿的潛在能力；在咖啡堿降解代謝過程中，存在聚多曲霉作用下的-脫甲基化和氧化，并以-脫甲基化為主。

普洱茶；固態發酵；聚多曲霉；咖啡堿；降解途徑

黑茶是一類由微生物主導下的后發酵茶類[1]。普洱茶（熟茶）是以云南大葉種茶樹鮮葉[(L.) Var.(Masteas Kitamura)]制成的曬青毛茶為原料，采取特定的加工工藝，加工形成具有獨特品質特征的茶葉[2]。渥堆發酵是普洱茶（熟茶）品質形成的關鍵工序。在普洱茶渥堆發酵中，咖啡堿含量多呈現顯著增加的變化趨勢[3]。然而，由于微生物的影響，在普洱茶渥堆發酵中偶爾會出現減少的趨勢[4-7]。大多數真菌和細菌對嘌呤堿的利用有限[8]，前人僅在茶園和咖啡園土壤中篩選鑒定出幾株可降解咖啡堿的有效菌株[9-10]。Zhou等[11]首次在普洱茶渥堆中發現可有效降解咖啡堿的菌株為聚多曲霉，其同源性高達99.8%。

咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）是茶葉中主要的生物堿和呈味物質[12]。研究證明，茶葉生物堿對人體心血管系統、生殖系統、呼吸和循環系統等方面的生理活性均有一定影響[13-16]。但咖啡堿的過量攝入不僅易造成腸胃功能失調、心悸、嗜睡、血壓升高等不良反應，甚至會增加失眠、焦慮、心臟負荷，降低生育率，骨質疏松等健康問題[17-19]。因此，人們十分關注與生物堿含量等相關的茶飲料的開發，對低咖啡堿飲料的需求也越來越迫切。

本文將普洱茶渥堆發酵中篩選鑒定出的優勢菌株分別接種至曬青毛茶中進行茶葉單菌種發酵，探究其對咖啡堿代謝的影響，從而確定可降解咖啡堿的優勢菌株，并采用UHPLC-QTOF-MS技術探究可降解咖啡堿菌株作用下的咖啡堿降解代謝途徑，為優勢菌株在茶葉加工中的應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

云南大葉種群體種[Var.(JW Masteas Kitamura)]曬青毛茶購自云南昆明茶葉市場。瓊脂粉（生化試劑）購自北京奧博星生物技術有限公司；乙腈（色譜純）購自美國飛世爾有限公司。咖啡堿（≥99%）、可可堿（≥99%）、茶堿（≥99%）標準品購自美國Sigma公司。

試驗菌株：NRRL250（聚多曲霉，GenBank登錄號：EF652450）、NRRL4789（GenBank登錄號：NR137468）CBS137324（GenBank登錄號KJ775437）和CBS253.31（GenBank登錄號：MH855205）篩選于普洱茶渥堆樣中，在實驗室–20℃條件下純甘油保存。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Agilent 1200型，美國安捷倫公司）。超高效液相色譜儀（Agilent 1290型，美國安捷倫公司）。高分辨質譜儀（Triple TOF? 6600型，美國AB Sciex公司）。色譜柱[ACQUITY BEH Amide型，規格（2.1?mm×100?mm×1.7?μm），Waters公司]。

1.2 方法

1.2.1 孢子菌懸液的制備

真菌菌株經PDA培養基活化后，用無菌水進行洗脫，轉移至錐形瓶，充分振蕩搖勻，并調節孢子濃度約為1.0×108CFU·mL-1（Colony forming units，CFU）于4℃保存備用。

1.2.2 真菌菌株的茶葉固態發酵[20]

稱取20?g曬青毛茶，其含水量為6.25%，與12.25?mL蒸餾水混合，使得固態發酵體系含水量為38%。1×105Pa滅菌后，每培養瓶接種1?mL目標菌株的種子菌懸液，并以接種1?mL無菌水的發酵組作為對照。培養瓶均放置于恒溫恒濕培養箱內（30℃，85%）進行固態發酵。參照普洱茶渥堆發酵方法，每3?d取樣1次，3次重復，采取HPLC測定茶樣中咖啡堿、可可堿和茶堿含量[21]。收集聚多曲霉接種發酵9?d時60℃條件下的烘干樣作為接種發酵組（IF），并以滅菌組（ST）和原料組（RM）為對照，分別進行代謝組學分析。

1.2.3主要嘌呤堿含量測定

咖啡堿、可可堿、茶堿等主要嘌呤堿含量采用高效液相色譜法（HPLC）測定。上樣液制備：稱取3?g磨碎試樣于500?mL錐形瓶中，加沸蒸餾水450?mL，立即移入沸水浴，浸提45?min（每隔l0?min搖動1次）。浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，并定容至500?mL。茶湯經0.45?μm水系膜過濾后進樣，進樣量為10?μL。色譜條件[22-23]：流動相為乙腈和0.2%乙酸水溶液的混合溶液，A相為乙腈，B相為0.2%乙酸水溶液，流速為1?mL?min-1。色譜柱：安捷倫反相Cl8色譜柱（250?mm×4.6?mm×5?μm）；檢測波長為280?nm；柱溫為30℃。洗脫程序為：0?min，A相8%，B相92%；50?min，A相31%，B相69%。采取梯度洗脫，程序運行結束10?min后進下一樣品。

1.2.4 茶葉代謝物萃取與上機檢測

稱取150?mg樣品于2?mL離心管中，加入1?500?μL提取液（甲醇︰乙腈︰水=2︰2︰1），再加入30?μL核糖醇，渦旋混勻10?s；加入瓷珠，45?Hz研磨儀處理4?min，超聲15?min（冰水?。?3?000?r·min-1離心15?min后提取上清液用于代謝組學檢測[24]。

用于代謝組學分析的液質聯用系統由Agilent 1290型超高效液相色譜儀串聯Triple TOF? 6600型高分辨質譜儀組成。流動相色譜條件：A相為25?mmol·L-1醋酸銨＋25?mmol·L-1氨水，B相為100%乙腈，進樣體積1?μL，流速500?μL·min-1；洗脫程序為：0~0.5?min，A相5%，B相95%；7?min，A相35%，B相65%；8~9?min，A相60%，B相40%；9.1~12?min，A相5%，B相95%。

質譜條件：AB 6600 Triple TOF質譜儀能夠在控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于IDA功能進行一級、二級質譜數據采集。在每個數據采集循環中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行采集對應的二級質譜數據。其電噴霧電離（ESI）離子源參數設置如下：在正、負離子模式下采集數據，噴霧電壓分別為5?500?V和–4?500?V。霧化氣（GS1）、輔助加熱氣（GS2）和氣簾氣（CUR）的壓力分別為60?Psi（1?Psi=6.89?kPa）、60?Psi、30?Psi，離子源溫度550℃，轟擊能量為35?eV；15張二級譜圖每個50?ms。

1.2.5 數據處理

采用XCMS做峰尋找、峰對齊等數據處理（XCMS版本號：1.41.0）。

物質鑒定的數據處理及匹配：設minfrac為0.5，cutoff為0.8。隨后基于XCMS開發的xcms4dda和xcms4lipid程序及自建庫進行數據處理，其篩選原則是在forward或reverse只要其中有1個被鑒定出來即保留該peak，首先對已鑒定的二級數據的peak進行篩選。然后對一級和二級數據的peak進行匹配，尋找一級數據中的peak在二級數據中對應的peak。按照mz tolerance±25?μg·mL-1進行匹配。

1.2.6 數據分析

正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）：使用SIMCA軟件（V14.1，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea, Sweden）對數據進行對數（Log）轉換加UV格式化處理。首先對第一主成分進行OPLS-DA建模分析，模型的質量用7折交叉驗證（7-fold cross validation）進行檢驗；然后用交叉驗證后得到的2（模型對分類變量的可解釋性）、2（模型對分類變量的可解釋性）和2（模型的可預測性）對模型有效性進行評判；最后通過置換檢驗（Permutation test），隨機多次改變分類變量的排列順序得到不同的隨機Q值，對模型有效性做進一步的檢驗。各組對比OPLS-DA模型的模型累積解釋率見表1。

表1 OPLS-DA模型參數表

注：2(cum)：代表模型對變量的累計解釋度；2(cum)：代表模型對變量的累計解釋度；2(cum)：模型的可預測性

Note:2(cum): represents the cumulative interpretation ofvariables by the model,2(cum): represents the cumulative interpretation ofvariables by the model, and predictability of the2(cum): model

單變量統計分析（UCA）：差異化合物篩選和鑒定本項目使用的卡值標準為Student′s檢驗的值小于0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度（Variable importance in the projection，VIP）大于1。

差異代謝物的代謝通路分析（Pathway analysis）：通過差異代謝物對KEGG、PubChem等權威代謝物數據庫進行映射，對應物種（Thale cress）的通路數據庫進行搜索和代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 茶葉微生物固體發酵中咖啡堿、可可堿、茶堿含量的變化

在NRRL4789CBS137324和CBS253.31接種發酵中，在不計干物質損耗的前提下，咖啡堿含量明顯有大幅度增加，增幅分別為23.32%、22.24%和16.46%，對咖啡堿降解代謝均無顯著影響（圖1）。僅在聚多曲霉（NRRL250接種發酵中，發現咖啡堿含量顯著下降（＜0.05），含量由原料中的(34.39±0.686)?mg·g-1降低至發酵末期的(5.54±0.548)?mg·g-1，降幅高達83.89%。因此，聚多曲霉應該是可降解咖啡堿的有效菌株，可用于探究微生物作用下的咖啡堿降解代謝。

在接種發酵和滅菌處理中可可堿含量均有所增加（圖2），特別在NRRL4789CBS137324和CBS253.31接種發酵中，可可堿有大幅度增加，增幅分別為21.10%、20.24%、11.58%。在滅菌處理中，可可堿的增幅約6.09%。在聚多曲霉接種發酵中可可堿僅有小幅度增加，增幅僅為4.15%左右。

由圖3可見，在NRRL4789、CBS13732和CBS253.31接種發酵和滅菌處理中，茶堿含量均無顯著性增加（＞0.05）。在聚多曲霉接種發酵中，茶堿顯著增加（＜0.05），由最初的0.43?mg·g-1增加至(25.03±1.172)?mg·g-1，增幅為原料的57倍以上。結合圖1中咖啡堿含量變化可知：在聚多曲霉發酵中，茶堿主要來自于咖啡堿的降解。

2.2 差異代謝物篩選

為進一步分析差異顯著的代謝物，將接種發酵組（IF）對原料組（RM）和滅菌組（ST）之間建立OPLS-DA模型并進行兩兩相互比較，以找出樣品間差異代謝產物。由表1可知，接種發酵組（IF）對原料組（RM）包含2個成分，其擬合參數為2=0.865，2=1，2=0.997，表明該模型的穩定性和預測率較高；接種發酵組（IF）對滅菌組（ST）包含2個成分，其擬合參數為2=0.504，2=1，2=0.993，表明該模型的穩定性和預測率較高。對OPLS-DA模型進行置換檢驗，模型的排列檢驗結果如圖4，由圖4可知，模型驗證結果參數：接種發酵組（IF）對原料組（RM）2截距為0.92，2截距為–0.51，發酵組（IF）對滅菌組（ST）2截距為0.8，2截距為–0.69，也表明該模型可靠，不存在過擬合現象。因此，采用建立的OPLS-DA模型進行后續的差異化合物篩選。

注：數值采用平均值±標準差表示，**表示同一處理下差異的顯著性水平（P＜0.05）。下同

圖2 單菌種接種發酵與滅菌處理中可可堿含量變化

注：數值采用平均值±標準差表示。**顯示差異的顯著性水平（P＜0.05）

圖4 IF-RM（a）和IF-ST（b）的差異代謝物OPLS-DA分析結果

2.3 聚多曲霉作用下的代謝通路富集分析

為探究微生物作用下咖啡堿降解代謝途徑，采用UHPLC-QTOF-MS方法對聚多曲霉接種發酵組（IF組），與原料組（RM組）和滅菌處理組（ST組）為對照進行代謝組學分析。在正、負離子模式下，通過二級質譜分別定性匹配288種和146種代謝物。將代謝物在HDMB、PubChem和KEGG等數據庫中進行匹配。正、負離子模式下，接種發酵組（IF組）和原料組（RM組）分別有92種和73種差異代謝物（VIP＞1且＜0.05）；接種發酵組（IF組）和滅菌處理組（ST組）分別有92種和67種差異代謝物（VIP＞1且＜0.05）。

在正、負離子模式下，基于接種發酵組（IF組）對原料組（RM組）差異代謝物的代謝通路進行富集分析（圖5）。接種發酵組（IF組）與原料組（RM組）在咖啡堿代謝（Caffeine metabolism）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、苯丙烷代謝（Phenylalanine metabolism）、核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、-亞麻酸代謝（-linolenic acid metabolism）、半乳糖代謝（Galactose metabolism）等方面存在顯著差異。

在正、負離子模式下，基于接種發酵組（IF組）對滅菌處理組（ST組）差異代謝物的代謝通路進行富集分析（圖6）。接種發酵組（IF組）與滅菌處理組（ST組）在苯丙烷代謝（Phenylalanine metabolism）、半乳糖代謝（Galactose metabolism）、核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、-亞麻酸代謝（-Linolenic acid metabolism）、色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）等方面存在顯著差異。

圖5 在負離子模式（a）與正離子模式下（b），基于接種發酵組（IF組）對原料組（RM組）差異代謝物的代謝通路富集分析圖

圖6 在負離子模式（a）與正離子模式下（b），基于接種發酵組（IF組）對滅菌處理組（ST組）差異代謝物的代謝通路富集分析圖

綜合接種發酵組（IF組）與原料組（RM組）和滅菌處理組（ST組）在咖啡堿代謝（Caffeine metabolism）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、苯丙烷代謝（Phenylalanine metabolism）、核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）等代謝通路富集上存在顯著差異。因此，聚多曲霉對氨基酸、碳水化合物、黃酮類和咖啡堿代謝有顯著影響（＜0.05）。

2.4 聚多曲霉作用下咖啡堿降解代謝途徑分析

本文采用UHPLC-QTOF-MS方法在接種發酵樣、滅菌處理樣、曬青毛茶原料樣中共檢測出咖啡堿、茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、1-甲基黃嘌呤、次黃嘌呤等7種嘌呤堿（表2）。相比于原料組（RM組）和滅菌處理組（ST組），在接種發酵組（IF組）中咖啡堿發生顯著降低（＜0.05），而茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤均顯著增加（＜0.05），1-甲基黃嘌呤在接種發酵過程中略有增加。

在聚多曲霉接種發酵中，咖啡堿的主要降解途徑如圖7所示。聚多曲霉作用下，咖啡堿降解代謝存在N-脫甲基化途徑和氧化途徑。通過N-脫甲基化反應，咖啡堿降解為茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、1-甲基黃嘌呤。其中部分降解產物，氧化后產生的1,7-二甲基尿酸和1-甲基尿酸均有小幅度增加。次黃嘌呤的顯著增加，可能和咖啡堿降解代謝相關。在聚多曲霉作用下，產生相關N-脫甲基酶，分別去除咖啡堿7號位甲基和3號位甲基生成茶堿和1,7-二甲基黃嘌呤，并且茶堿為主要咖啡堿降解產物，1,7-二甲基黃嘌呤為次要降解產物。

3 討論

本文以滅菌處理為對照，采用NRRL250（聚多曲霉）、NRRL4789、CBS137324和CBS253.31等4株優勢菌株分別接種至曬青毛茶進行茶葉固態發酵，并采用HPLC測定咖啡堿、可可堿和茶堿等嘌呤堿含量。結果表明，NRRL4789、CBS137324和CBS253.31對咖啡堿、可可堿、茶堿等嘌呤堿代謝無顯著影響，這與普洱茶自然渥堆[25]和茶葉單菌種發酵[3]的研究結果基本一致。此外，本文僅在聚多曲霉接種發酵中發現咖啡堿含量顯著下降（＜0.05），茶堿含量顯著增加（＜0.05），這與前人研究結果一致[22]。另外，有研究報道茶堿是咖啡堿主要的代謝產物和限速步驟[26-27]。綜上所述，在普洱茶發酵中咖啡堿降解的優勢菌株為聚多曲霉，并具有將咖啡堿轉化為茶堿的潛在能力。

表2 不同處理組中咖啡堿代謝相關代謝物的相對含量和倍數變化

注：代謝物的相對含量為3個重復通過LC-MS/MS獲得數據的平均值，相對含量是內標歸一化后的值，其內標為核糖醇（≥99%）。RM為原料組，ST為滅菌處理組，IF為接種發酵組。倍數變化通過公式log2（處理/對照）進行計算。**表示同列差異顯著性水平（＜0.05）

Note: Relative content of each metabolite is an average of data from three replicates obtained through LC-MS/MS. The relative content is the normalized value of the internal standard, and the internal standard is ribose alcohol (≥99%). RM stands for Raw material, ST stands for Sterilization treatment, IF stands for Inoculated fermentation. Fold changes were calculated using the formula log2(treatment/control). ** indicates significance of the same column (＜0.05)

注：藍色箭頭（→）表示在SSF中檢測到的N-脫甲基化通路。紅色箭頭（→）表示在SSF中檢測到的氧化通路。棕色箭頭（→）表示在SSF中未檢測到的可能通路

運用UHPLC-QTOF-MS的代謝組學分析探究聚多曲霉作用下第9天發酵樣中咖啡堿降解代謝相關的物質，發現茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、1-甲基黃嘌呤、1-甲基尿酸、次黃嘌呤均顯著增加（＜0.05）。其中，茶堿含量與HPLC檢測結果一致。由此可見，茶堿作為N-脫甲基作用下咖啡堿降解的主要產物，進一步降解為3-甲基黃嘌呤或1-甲基黃嘌呤。而1,7-二甲基黃嘌呤作為-脫甲基作用下咖啡堿降解的次要產物，可通過-脫甲基作用進一步降解為7-甲基黃嘌呤或1-甲基黃嘌呤。

前人研究發現，茶樹生理中咖啡堿的分解代謝途徑以咖啡堿→茶堿→3-甲基黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸→尿囊素→尿囊酸→乙醛酸→尿素→NH3+CO2為主[28-29]。在本研究中，在聚多曲霉作用下咖啡堿降解代謝中存在著-脫甲基作用和氧化作用，并以-脫甲基化作用為主，且以咖啡堿→茶堿→3-甲基黃嘌呤降解為主途徑，這與Mccarthy等[30]的研究結果一致。另外，在極少數的青霉屬和曲霉屬類群中，真菌分解代謝咖啡堿會逐級代謝為茶堿和3-甲基黃嘌呤[31]，并且以咖啡堿→1,7-二甲基黃嘌呤→7-甲基黃嘌呤降解途徑為輔。1-甲基黃嘌呤的增加可能源于茶堿或1,7-二甲基黃嘌呤的進一步降解[32]。同時，通過氧化作用，少量1,7-二甲基黃嘌呤和1-甲基黃嘌呤可氧化成甲基尿酸，這與細菌參與下的嘌呤堿代謝途徑一致。1,7-二甲基尿酸亦可脫甲基形成1-甲基尿酸，與Cornish等[32]在動物體內發現咖啡堿通過脫甲基后轉化為1,7-二甲基黃嘌呤，進一步脫甲基后轉化為1-甲基黃嘌呤，再氧化為1-甲基尿酸的代謝途徑一致。-脫甲基作用是由相關的-脫甲基酶催化咖啡堿3個位點的甲基完成，最終生成黃嘌呤。目前關于茶葉中-脫甲基酶的研究報道較少。運用-脫甲基酶相關基因的超表達促使咖啡堿的降解，定向生產相應嘌呤堿存在不少難題。研究-脫甲基酶相關基因簇將促進生物降解嘌呤堿技術的研發，對解決相關領域應用咖啡堿產生的問題具有現實意義。

[1] Zhang L, Zhang Z Z, Zhou Y B, et al. Chinese dark teas: Postfermentation, chemistry and biological activities [J]. Food Research International, 2013, 53(2): 600-607.

[2] 全國原產地域產品標準化工作組. 地理標志產品普洱茶: GB/T 22111—2008 [S]. 北京: 北京標準出版社, 2008.National regional product standardization working group of the People's Republic of China. Geographical indication products Pu-erh tea: GB/T 22111—2008 [S]. Beijing: Beijing Standard Press, 2008.

[3] 陳華紅, 李雪玲, 巖燕, 等. 頂頭孢霉對普洱茶品質的影響[J]. 食品科技, 2011, 36(10): 53-56.Chen H H, Li X L, Yan Y, et al. The effects of a strain of Cephalosporium acremonium on the quality of Pu-er tea [J]. Food Science and Technology, 2011, 36(10): 53-56.

[4] Lv H P, Zhang Y J, Lin Z, et al. Processing and chemical constituents of Pu-erh tea: A review [J]. Food Research International, 2013, 53(2): 608-618.

[5] Zhang L, Li N, Ma Z Z, et al. Comparison of the chemical constituents of aged Pu-erh tea, ripened Pu-erh tea, and other teas using HPLC-DAD-ESI-MSn [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(16): 8754-8760.

[6] Wang D, Xu K L, Zhong Y, et al. Acute and subchronic oral toxicities of Pu-erh black tea extract in Sprague-Dawley rats [J]. Journal of ethnopharmacology, 2011, 134(1): 164. doi: 10.1016/j.jep.2010.11.068.

[7] Wang D, Xiao R, Hu X T, et al. Comparative safety evaluation of Chinese Pu-erh green tea extract and Pu-erh black tea extract in Wistar rats [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(2): 1350-1358.

[8] Hollingsworth R G, Armstrong J W, Campbell E. Caffeine as a repellent for slugs and snails [J]. Nature, 2002, 417(6892): 915-916.

[9] 栗娜, 籍保平, 李博, 等. 可降解咖啡堿菌株的篩選與鑒定[J]. 食品科學, 2010, 31(21): 218-221.Li N, Ji B P, Li B, et al. Screening and identification of astrain capable of degrading caffeine [J]. Food Science, 2010, 31(21): 218-221.

[10] Gokulakrishnan S, Chandraraj K, Gummadi S N. A preliminary study of caffeine degradation bysp. GSC 1182 [J]. International Journal of Food Microbiology, 2007, 113(3): 346-350.

[11] Zhou B X, Ma C Q, Wang H Z, et al. Biodegradation of caffeine by whole cells of tea-derived fungi,and optimization for caffeine degradation [J]. BMC Microbiology, 2018, 18(1): 53. doi: 10.1186/s12866-018-1194-8.

[12] Scharbert S, Hofmann T. Molecular definition of black tea taste by means of quantitative studies, taste reconstitution, and omission experiments [J]. J Agric Food Chem, 2005, 53(13): 5377-5384.

[13] He R, Chen L, Lin B, et al. Beneficial effects of oolong tea consumption on diet-induced overweight and obese subjects [J]. Chinese Journal of Integrative Medicine, 2009, 15(1): 34-41.

[14] 顧陳菲, 寶麗, 謝果, 等. 狹葉茶提取物對小鼠氧化應激性肝損傷的保護作用[J]. 茶葉科學, 2008, 28(2): 115-122.Gu C F, Bao L, Xie G, et al. Protective effects ofchang on oxidative stress-induced liver damage in mice [J]. Journal of Tea Science, 2008, 28(2): 115-122.

[15] Kurihara H, Fukami H, Asami S, et al. Effects of oolong tea on plasma antioxidative capacity in mice loaded with restraint stress assessed using the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay [J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2004, 27(7): 1093-1098.

[16] Nawrot P, Jordan S, Eastwood J, et al. Effects of caffeine on human health [J]. Food Additives and Contaminants, 2003, 20(1): 1-30.

[17] 黃麗鳳, 劉友平, 黎代余. 茶多酚提取純化工藝研究進展[J]. 中國食品添加劑, 2010(1): 69-72.Huang L F, Liu Y P, Li D Y. Advances on research of purification of tea polyphenols from green tea leaves [J]. China Food Additives, 2010(1): 69-72.

[18] 姚永宏, 柴友榮, 李中林, 等. 降低茶葉咖啡堿的研究進展[J]. 西南農業學報. 2009, 22(6): 1799-1802.Yao Y H, Cai Y R, Li Z L, et al. Research progress for tea decaffeination [J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2009, 22(6): 1799-1802.

[19] Iancu I, Strous R D. Caffeine intoxication: history, clinical features, diagnosis and treatment [J]. Harefuah, 2006, 145(2): 147-151, 163-164.

[20] Wang Q P, Gong J S, Chisti Y, et al. Fungal isolates from a Pu-erh type tea fermentation and their ability to convert tea polyphenols to theabrownins [J]. J Food Science, 2015, 80(4): M809-M817.

[21] 馬存強, 王洪振, 周斌星, 等. 普洱茶固態發酵中轉化咖啡堿為茶堿菌株的鑒定與應用[J]. 食品工業科技, 2018, 39(15): 119-124.Ma C Q, Wang H Z, Zhou B X, et al. Identification and application of fungal converting caffeine to theophylline from Pu-erh tea solid-state fermentation [J]. Science and Technology of Food Industry, 2018, 39(15): 119-124.

[22] 馬存強, 周斌星, 王洪振, 等. 普洱茶渥堆發酵中可降解咖啡堿真菌菌株的篩選和鑒定[J]. 茶葉科學, 2017, 37(2): 211-219.Ma C Q, Zhou B X, Wang H Z, et al. Screen and identification of fungi strain degrading caffeine in Pu-erh tea during solid-state fermentation [J]. Jounal of Tea Science, 2017, 37(2): 211-219.

[23] Wang X G, Wan X C, Hu S X, et al. Study on the increase mechanism of the caffeine content during the fermentation of tea with microorganisms [J]. Food Chemistry, 2008, 107(3): 1086-1091.

[24] Ivanisevic J, Elias D, Deguchi H, et al. Arteriovenous blood metabolomics: a readout of intra-tissue metabostasis [J]. Sci Rep, 2015, 5(1): 12757.doi: 10.1038/srep12757.

[25] Liang Y R, Zhang L Y, Lu J L. A study on chemical estimation of Pu-erh tea quality [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85(3): 381-390.

[26] Ashihara H, Gillies F M, Crozier A. Metabolism of caffeine and related purine alkaloids in leaves of tea (L.) [J]. Plant and Cell Physiology, 1997, 38(4): 413-419.

[27] Woolfolk C A. Metabolism of N-methylpurines by a Pseudomonas putida strain isolated by enrichment on caffeine as the sole source of carbon and nitrogen [J]. Journal of bacteriology, 1975, 123(3): 1088-1106.

[28] Ashihara H, Sano H, Crozier A. Caffeine and related purine alkaloids: biosynthesis, catabolism, function and genetic engineering [J]. Phytochemistry, 2008, 69(4): 841-856.

[29] Mazzafera P. Catabolism of caffeine in plants and microorganisms [J]. Frontiers in Bioscience, 2004(9): 1348-1359.

[30] Mccarthy A A, Mccarthy J G. The structure of two N-methyltransferases from the caffeine biosynthetic pathway [J]. Plant Physiol, 2007, 144(2): 879-889.

[31] Hakil M, Denis S, Viniegra-González G, et al. Degradation and product analysis of caffeine and related dimethylxanthines by filamentous fungi [J]. Enzyme and Microbial Technology, 1998, 22(5): 355-359.

[32] Cornish H H, Christman A A. A study of the metabolism of theobromine, theophylline, and caffeine in man [J]. J Biol Chem, 1957, 228(1): 315-323.

A Preliminary Study on the Degradation Pathway of Caffeine in Tea Microbial Solid-state Fermentation

ZHENG Chengqin1, MA Cunqiang1,2, ZHANG Zhengyan1, LI Xiaohong1, WU Tingting1,ZHOU Binxing1*

1. Longrun Pu-erh Tea College, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Kunming Dapu Tea Industry Company Limited, Kunming 650224, China

In order to explore caffeine degradation products and pathways under the action of microorganisms, the dominant strains includingNRRL250,NRRL4789,CBS137324 andCBS253.31 were screened and identified during pu-erh tea fermentation.Strains were inoculated into sun-dried green tea leaves for solid-state fermentation. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine caffeine, theobromine and theophylline contents to explore the effect of microorganisms on caffeine metabolism. UHPLC-QTOF-MS was used for the metabonomic analysis ofinoculated fermentation with sterilization treatment group (ST group) and raw material group (RM group). The results show that the dominant strains such asNRRL4789,CBS137324 andCBS253.31 had no significant effects on the metabolism of caffeine and other purine alkaloids. However, caffeine content was decreased significantly (＜0.05) with a great reduction about 83.89% during the inoculated fermentation of. Additionally, theophylline content was increased significantly (＜0.05) and arrived to (25.03±1.17)?mg·g-1at the end of fermentation.While theobromine content remained stable. Therefore,has a profound effect on caffeine degradation metabolism. Nine metabolites related to caffeine degradation were detected by UHPLC-QTOF-MS during the inoculated fermentation, Among them, theophylline, 3-methylxanthine, 1,7-dimethylxanthine and 7-methylxanthine contents were significantly increased (＜0.05) under the action ofwhich were related to N-demethylation pathway of caffeine and its related metabolites. 1,7-dimethyluric acid and 1-methyluric acid were related to the oxidation pathway of caffeine-related metabolites. It can be seen thatis the dominant strain that can degrade caffeine and has the potential ability to convert caffeine into theophylline. Under the action of, both N-demethylation and oxidation were found in caffeine degradation metabolism, and the former was the dominant.

Pu-erh tea, solid-state fermentation,, caffeine, degradation pathway

SI詞頭符號表

因數詞頭中文名稱詞頭符號因數詞頭中文名稱詞頭符號 1024堯Y10-1分d 1021澤Z10-2厘c 1018艾E10-3毫m 1015拍P10-6微μ 1012太T10-9納n 109吉G10-12皮p 106兆M10-15飛f 103千K10-18阿a 102百H10-21仄z 101十da10-24幺y

S571.1；Q52

A

1000-369X(2020)03-386-11

2019-11-26

2019-12-23

云南農業云南省現代茶葉產業體系（2017KJTX007）、國家自然科學基金項目（31960617）、國家自然科學基金項目（31760225）、國家自然科學基金項目（31560221）

鄭城欽，男，碩士，主要從事制茶工程與質量控制方面的研究。*通信作者：bxzhou01@126.com

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