非損傷微測Zn2+選擇性微電極的研發及應用①

張云超，李連禎，徐世艾，于順洋，李瑞杰，駱永明,4

(1 煙臺大學化學化工學院，山東煙臺 264005；2 中國科學院煙臺海岸帶研究所，海岸帶環境過程與生態修復重點實驗室，山東煙臺264003；3 中國科學院海洋大科學研究中心，山東青島 266071；4 中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所)，南京210008)

深入認識重金屬離子在植物根際微界面的過程與機制有助于揭示植物適應重金屬脅迫的生理機制，同時也可為控制重金屬向食物鏈遷移提供科學依據。受技術手段限制，對植物吸收富集重金屬離子的研究通常是以植物的整個器官或組織作為研究對象并通過化學方法分析其含量[1-3]。這些傳統分析方法操作相對簡單、易行，但同時也存在其局限性，主要表現在兩方面：其一，對樣本的破壞性，不能反映活體植物吸收金屬離子的特性；其二，分析的時空分辨率低，其反映的是一定時間內整個器官或組織對某種離子吸收濃度的平均值，無法實時測定根系微區離子的動態吸收過程。后來出現的同位素示蹤、熒光顯微成像技術和膜片鉗技術等，雖然也在一定程度上可以對活體植物的離子分布和運動規律進行檢測，但是這些方法普遍具有時間分辨率差的缺點。

非損傷微測技術(Non-invasive Micro-test Technology，NMT)是一種實時、動態測定活體材料的新技術，它通過測定進出材料的離子或分子的流速反映生命活動的規律，是生理功能研究的最佳工具之一[4-5]。1990年，美國科學家Kühtreiber 和Jaffe[6]首次提出掃描微電極技術(非損傷微測技術起源)并成功測量出了Ca2+進出細胞的流速，從而開創了由生物活體靜態測量到動態測量轉變的先河。非損傷微測技術具有獨特的分析時間(0.5 s)和空間(2 ～ 5 μm)分辨率，它的測定過程在根的表面完成而不需要侵入植物體，從而很好地避免了對樣本的破壞性而帶來的研究誤差甚至假象。因此，利用這個技術能夠對植物吸收、釋放及轉運離子或者分子的根際過程和機制形成更深入的理解和統一認識。

目前可以搭載在非損傷微測系統上使用的微電極有玻璃電極、碳絲電極和金屬電極等類型；可以檢測的離子或分子主要有Ca2+、H+、K+、Na+、Mg2+、NH4+、Cl–、NO–3、Cd2+、Cu2+、Pb2+及O2、H2O2、CO2、NO 等[7-17]；被測樣品不僅僅局限于植物，也可以應用于細胞、動物等生命樣品和金屬材料、顆粒材料和膜材料等非生命樣品。NMT 目前已廣泛應用于植物生長發育和逆境脅迫等研究領域，受重金屬微傳感器種類的限制，其在重金屬毒理效應與機制研究中的應用亟待進一步拓展和深入。Zn 作為一種植物生長的必需微量元素，在植物的生長發育過程中發揮著至關重要的作用[18]，但當其在植物體內的累積量達到一定值時也會表現出毒性效應[19]。隨著Zn 肥在農業中的廣泛應用、Pb/Zn 礦的開發以及工業廢水的排放和大氣沉降過程等影響，導致Zn 在土壤中大量積累[20]。利用非損傷微測技術可以對Zn2+在植物根際微界面的動態過程進行實時、活體檢測，這將有助于我們深入認識植物適應Zn 毒害的生理機制。然而，由于傳統Zn2+選擇性宏觀電極所使用的離子載體普遍存在靈敏性低、對其他離子抗干擾性差、響應時間長等問題，無法用于非損傷微測系統的微傳感器中。為實現活體植物根表Zn2+離子流的實時、動態檢測，需開發、表征、優化一種新型Zn2+選擇性微電極來滿足非損傷微測系統對離子流檢測的要求。

伴礦景天(Sedum plumbizincicola)作為我國發現的Zn/Cd 超積累植物[21-26]，因其對Zn 和Cd 超富集能力已被成功應用于治理修復Zn/Cd 污染土壤[27]。本研究以伴礦景天幼苗作為受試生物材料，通過研發的新型非損傷微測Zn2+選擇性微電極成功實現了植物根際Zn2+離子流的實時、動態、活體檢測，同時與其根際不同微區的Cd2+離子流特征進行了對比研究。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與材料

本研究所用試劑硝酸銅[Cu(NO3)2]、硝酸鉛[Pb(NO3)2]、硝酸鈣[Ca(NO3)2]、硝酸鎂[Mg(NO3)2]、硝酸鈉(NaNO3)、硝酸鎘[Cd(NO3)2]、硝酸鉀(KNO3)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化鉀(KCl)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)均為分析純試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司；鋅離子載體 Ⅰ(tetra-n-butyl thiuram disulfide，TBTDS)、鋅離子載體 Ⅳ(Potassium hydrotris(Ntert-butyl-2-thioimidazolyl)borate，[TmBut]K)、鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)、硝基苯辛基醚(2-Nitrophenyl octyl ether, o-NPOE)、四(3,5-二(三氟甲基)苯基)硼酸鈉(Sodium tetrakis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]borate, NaBARF)均購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

本研究有關微電極的表征與應用測試在非損傷微測系統(YG-MS-001，美國楊格公司)上完成。所用玻璃毛細電極管(XY-CGQ-01)、液體離子交換劑(liquid ions exchanger，LIX)載體管(XY-LIX-01)和Cd2+LIX 均購于旭月(北京)科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Zn2+選擇性微電極的制備 Zn2+選擇性微電極主要包括玻璃毛細電極管、液體離子交換劑LIX和膜后灌充液3 部分。LIX 主要包括離子載體、親脂性鹽和溶劑3 部分。LIX 和膜后灌充液的制備參考文獻[28-35]，并進一步優化改進。首先用接細管的注射器將膜后灌充液從玻璃毛細電極管尾部緩慢推入內部，產生一段液柱(長度約10 mm)直至電極尖端有液體滲出。在顯微鏡下觀察電極內部是否有氣泡產生，若產生氣泡，須將電極尖端垂直向下放置一段時間，直至氣泡完全消失，將玻璃毛細電極管置于顯微鏡下備用。然后用LIX 載體管蘸取少量LIX，制作成LIX池，從尾部給予一定壓力使其液面凸出。最后將其放入顯微鏡下與玻璃毛細電極管置于一個平面，使玻璃毛細電極管尖端接觸到LIX 凸液面，LIX 會逐漸吸入玻璃毛細電極管尖端。當LIX 在玻璃毛細電極管中的長度達到100 ～ 120 μm 時將其取下，插在固定器的Ag/AgCl 絲上并與非損傷微測系統連接備用。

1.2.2 Zn2+選擇性微電極的能斯特斜率測試 首先配制不同Zn2+濃度的標定液，在非損傷微測系統完成不同標定液電位E的測定。電位E與標定液Zn2+濃度C之間的關系可以用能斯特方程[36]來描述。

式中：E為微電極與參比電極之間的電壓，mV；C為標定溶液中Zn2+濃度，mol/L；s為能斯特斜率，mV/decade；k為能斯特截距，mV。其中能斯特斜率s理論值的計算公式為：

式中：R為氣體常數，8.314 J/(K·mol)；T為絕對溫度，K；F為法拉第常數，9.6487×104C/mol；n為被測離子的化合價，對于Zn2+，n= 2。在25 °C 時，Zn2+的能斯特斜率s理論值為29.5 mV/decade。

1.2.3 Zn2+選擇性微電極的線性響應范圍 離子選擇性微電極在一定檢測范圍內電位和濃度的對數呈線性關系。對不同Zn2+濃度的標定液使用同一根微電極分別進行3 次測量取平均值，得到不同Zn2+濃度的對數與微電極電位之間的關系，即微電極的校正曲線，從而求得Zn2+選擇性微電極的線性范圍。

1.2.4 Zn2+選擇性微電極的響應時間測試 Zn2+選擇性微電極應用于非損傷微測系統時，響應時間是一個重要的參數。根據IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry，國際純粹與應用化學聯合會)的推薦，離子選擇性微電極的響應時間是指從微電極和參比電極接觸標定液時算起(或由標定液中被測物質的濃度發生改變時算起)，到電位穩定值的95% 所經歷的時間(t95%)[37]。本研究使用不同的Zn2+選擇性微電極分別對10–3、10–4mol/L 的Zn2+標定液進行多次t95%的測定，尋求響應時間最短的微電極。

1.2.5 Zn2+選擇性微電極的選擇性系數 本研究通過分別溶液法[38]計算選擇性系數。將微電極浸入只含有Zn2+溶液中，測得其電位值EZn，然后再將其浸入與主離子濃度相等的只含干擾離子的溶液中，測出其電位值EJ。然后使用以下公式進行計算：

式中：ZJ代表干擾離子所帶電荷數；?Zn、?J分別代表Zn2+和干擾離子的活度，mol/L；F代表法拉第常數；R代表理想氣體常數。

1.2.6 Zn2+選擇性微電極的穩定性測試 良好的穩定性是Zn2+選擇性微電極應用于非損傷微測系統的必要條件。將Zn2+選擇性微電極分別浸入不同濃度的Zn2+標定液中，測定一段時間內的電位值和電位差，電位值和電位差的變化情況可以反映出Zn2+選擇性微電極的穩定性。

1.3 供試植物及其生長條件

伴礦景天是我國本土發現的一種Zn/Cd 超積累植物，幼苗由中國科學院南京土壤研究所提供。在實驗室以無性繁殖的方式(扦插)種植，培養在Hogland[39]營養液中，組成為：1.0 mmol/L Ca(NO3)2，1.0 mmol/L K(NO3)，0.4 mmol/L MgSO4，0.2 mmol/L KH2PO4，10 μmol/L Fe( Ⅱ)-EDTA，9 μmol/L H3BO4，0.2 μmol/L ZnSO4，0.1 μmol/L CuSO4，2 μmol/L MnSO4，0.02 μmol/L (NH4)6Mo7O24。營養液pH 每天用0.1 mol/L HCl 或者0.1 mol/L NaOH 調節至6.0 左右，植物在人工氣候室下培養(光周期為白天16 h，黑夜8 h；白天溫度25 °C，黑夜溫度18 °C；濕度為75%)，保持全天候通氣，每兩天換一次營養液。

1.4 離子流的檢測

受試植物伴礦景天幼苗的根用去離子水洗凈并固定在培養皿中，加入測試液(組成為0.05 mmol/L Zn(NO3)2，0.1 mmol/L Ca(NO3)2，0.1 mmol/L KNO3、0.1 mmol/L Mg(NO3)2和1 mmol/L NaNO3)，平衡10 min 至Zn2+流速穩定。將制備好的Zn2+選擇性微電極與非損傷微測系統連接，在標準溶液標定完成后分別檢測伴礦景天根尖部位(0 ～ 1 000 μm)Zn2+離子流。另外，Cd2+選擇性微電極制備和離子流檢測流程與Zn2+相似。

離子通量的計算由Fick 第一擴散定律求得。通過測定根際表面到X 方向30 μm 兩點之間的電位差ΔV，從而求得ΔC，離子通量由以下計算公式求得：

式中：J為X 方向的離子通量，10-12mol/(cm2·s)；D為離子分子的擴散系數是離子濃度梯度，pmol/cm4。

2 結果與討論

2.1 Zn2+ 選擇性微電極的表征

2.1.1 能斯特斜率和校正曲線 本研究首先通過篩選不同的Zn2+載體，排除不能直接溶解于溶劑(o-NPOE 和DBP)中的離子載體；其次，通過調整離子載體(TBTDS、[TmBut]K)與其他組分配比配制LIX，對其進行能斯特斜率表征。當TBTDS、NaBARF和o-NPOE 質量比為1︰1︰8 時，微電極能斯特斜率最接近理論值(表1)，故選用此種組分配比作為Zn2+選擇性微電極的LIX。進一步通過調整微電極其他的組分來進一步優化微電極的性能。

表1 不同組分配比的LIX 對微電極斜率的影響Table 1 Effects of different ratios of LIX on slopes of microelectrodes

在離子流測試過程中需要保持植物根的正常生理狀態，需要在測試液中加入營養離子。本研究同時配制了簡易模擬土壤溶液(0.1 mmol/L Ca(NO3)2，0.1 mmol/L KNO3，0.1 mmol/L Mg(NO3)2和1 mmol/L NaNO3)來評價微電極的性能。將做好的Zn2+微電極與非損傷微測系統連接，分別浸入Zn2+濃度為10–6、10–5、5×10–5、10–4、10–3、10–2和10–1mol/L 的去離子水和簡易模擬土壤溶液中，測得輸出電位。由圖1可知，微電極在去離子水中的線性響應范圍為10-6～10–1mol/L，其能斯特斜率為30.2 mV/decade；在簡易模擬土壤溶液中，由于共存陽離子的干擾，在低于50 μmol/L 的Zn2+濃度時其電位發生偏移，但在5×10–5～ 10–1mol/L 范圍內仍然呈線性響應，能斯特斜率為28.1 mV/decade。可以看出此微電極在含有不同Zn2+濃度的去離子水和簡易模擬土壤溶液中均具有接近于理論值的能斯特響應斜率，這也為后續Zn2+離子流檢測結果的準確性和可信度提供了保障。微電極在含有營養離子的簡易模擬土壤溶液中也具有較好的能斯特斜率，表明此電極對共存離子表現出較好的抗干擾性。

圖1 Zn2+ 微電極在去離子水和模擬土壤溶液中的校正曲線Fig. 1 Calibration curves of Zn2+ microelectrode in deionized water and simulated soil solution

2.1.2 選擇性系數 本研究所用的離子載體TBTDS 為一種中性載體，在離子選擇性電極的研究中普遍證實，中性載體膜往往只對陽離子具有滲透性。因此，它的電化學性能幾乎不受親水陰離子(如Cl–、NO)的影響[40-43]。本研究探究微電極對共存陽離子的選擇性，采用公式(3)對微電極的選擇性系數進行計算。分別配制濃度為10–2、10–3、10–4mol/L的Ca(NO3)2、KNO3、Mg(NO3)2、NaNO3、Cu(NO3)2、NH4NO3、Pb(NO3)2、Cd(NO3)2，使用同一根微電極分別測定電位，計算出微電極的選擇性系數。由表2可見，微電極對大部分陽離子表現出較好的選擇性，計算所得的值為 –3 左右，表明只有比Zn2+高出1 000 倍活度的干擾離子才足以干擾微電極對Zn2+的選擇性響應。微電極對Cu2+和Pb2+選擇性較差，可能是由于所用離子載體TBTDS 中含有S 原子，而S 原子對Cu2+和Pb2+具有更強的親和力而干擾了微電極對Zn2+的響應[30]。

表2 微電極的選擇性系數以及與其他研究的對比Table 2 Selectivity coefficients of microelectrodes in this and others studies

2.1.3 pH 對微電極的影響 配制10-3mol/L 的Zn(NO3)2溶液，調節pH 范圍為2.5 ～ 7.5，分別測試電位。由圖2 可得，pH 在3.5 ～ 7.0 范圍內電位穩定，微電極在此pH 范圍內可以正常工作。當pH 低于3.5時，微電極受H+的干擾，電位會有所上升；當pH 達到 7.0 后，由于Zn2+的水解(Zn2++2H2O→Zn(OH)2+2H+)，導致Zn2+的濃度下降，電位也隨之下降。這表明微電極可以保證在適合植物生長的pH環境下進行穩定的離子流測試。

圖2 pH 對Zn2+ 微電極電位的影響Fig. 2 Effect of pH on the potential of Zn2+ microelectrode

2.1.4 響應時間 研究發現膜后灌充液對微電極的響應時間有很大的影響。由表3 可知，膜后灌充液組成為10 mmol/L Zn(NO3)2和0.1 mmol/L KCl 時微電極有最短的響應時間。最終選用組成為10 mmol/L Zn(NO3)2和0.1 mmol/L KCl 溶液作為膜后灌充液，響應時間t95%≤ 1 s。微電極較短的響應時間可以節約測試時間，也可以保證離子流測試結果的真實可靠性。

表3 不同灌充液對微電極響應時間的影響Table 3 Effects of different inner liquids on response time of microelectrode

2.1.5 穩定性 在使用NMT 測試樣品過程中，信號的穩定性至關重要，所以必須保證微電極本身有穩定的電位值。通過非損傷微測系統測定了電極在10–3、10–4mol/L Zn(NO3)2標定液中一段時間內的電位值和電極移動一段距離(30 μm)所產生的電位差。如圖3 所示，微電極在10 min 內電位值幾乎不發生改變，電位差也接近于0。這表明微電極有非常好的穩定性，在檢測過程中可以避免電位波動所帶來的誤差。

圖3 Zn2+ 微電極的穩定性測試Fig. 3 Stability test of Zn2+ microelectrode

2.2 植物根際Zn2+ 離子流的檢測

在對Zn2+微電極進行優化和表征后，搭載非損傷微測系統對伴礦景天幼苗進行了根際不同微區Zn2+離子流進行了測定，離子通量由公式(4)計算得出。如圖4 所示，伴礦景天在距離根尖600 μm 內Zn2+凈通量為內吸，且在300 μm 處有最強的吸收速率，在700 ～ 1 000 μm 處則有明顯的Zn2+外排信號。同時，通過Cd2+微電極測得的根際Cd2+離子流數值盡管較Zn2+低，但其在不同微區的輪廓與Zn2+離子流具有類似的規律，表現在距離根尖端0 ～ 500 μm 處吸收，在600 ～ 1 000 μm 處則表現為外排(圖5)。

圖4 伴礦景天根際Zn2+ 離子流測試Fig. 4 Zn2+ flux across rhizosphere of Sedum plumbizincicola

圖5 伴礦景天根際Cd2+ 離子流測試Fig. 5 Cd2+ flux across rhizosphere of Sedum plumbizincicola

伴礦景天作為一種Cd/Zn 超積累植物，其對高濃度的重金屬表現出一定的抗性和耐受性。通過非損傷微測技術發現其在根尖微區存在外排Zn2+、Cd2+的部位，這可能是其避免高濃度重金屬對其根部造成損害的一種主動防御措施。作為一種解毒重金屬的重要手段，植物可以通過根部主動排出金屬離子來降低細胞中不需要的金屬濃度，這種依賴于ATP 的外排機制首先在白玉草(Silene vulgaris)的根中發現[44]，后來也在其他植物的根中發現[45]。但是這種植物主動外排金屬離子的分子生物學過程機制目前尚不完全清楚，值得深入分析和研究。

3 結論

本研究建立了一種性能優異的非損傷微測Zn2+選擇性微電極，并首次實現了對植物根際微區Zn2+離子流的實時、活體檢測。這種基于非損傷微測的Zn2+離子流檢測技術為活體條件下深入認識Zn2+在植物根-液以及根-莖等微界面的動態傳輸過程與機制提供了一種強有力的研究手段。