富血小板血漿對MRSA的體外抑菌作用研究

吳日釗 霍景山 劉海燕 張偉霞 鐘婉婷

1.廣東省佛山健翔醫(yī)院普通外科，廣東佛山 528000；2.廣東省佛山市中醫(yī)院外一科，廣東佛山 528000；3.廣東省佛山健翔醫(yī)院檢驗科，廣東佛山 528000；4.廣東省佛山市中醫(yī)院檢驗科，廣東佛山 528000

富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）是近年熱門探討的生物療法技術，是通過離心全血而獲得的含有高濃度血小板的血漿，將其與凝血酶-鈣劑按比例混合可制成血小板凝膠[1]（platelet gel，PG）。高濃度血小板激活后可釋放大量生長因子[2]，目前主要用于慢性創(chuàng)面修復[3]、骨與軟組織再生[4]、整形美容方面[5]的研究。筆者臨床用PRP 制成PG 修復反復感染的難治性慢性創(chuàng)面時，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面感染狀況改善，思考PRP 具有抑菌作用。故筆者擬通過PRP 對慢性創(chuàng)面常見的難治的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）進行體外抑菌實驗研究，為進一步探討PRP 治療慢性創(chuàng)面提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器與試劑 全自動血細胞分析儀（邁瑞5380），數(shù)顯恒溫水浴箱（金壇科析HHW600），全自動洗滌離心機（上海耐圣卡蘭 XTL-417W），一次性無菌真空采血管（蘇州康健），麥氏比濁儀（北京中瑞祥ZRX-29417），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北納生物），PBS 磷酸緩沖鹽溶液（海標科技1000mL）。

1.1.2 菌株 標準耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株 （MRSA，ATCC 43300）購自北京中科質檢生物技術公司。

1.2 研究對象

本研究經醫(yī)院倫理委員會討論通過。2019年3 ～8 月在廣東省佛山市內征集24 例健康志愿者，男12 例，女12 例，年齡20 ～35 歲，平均（26.1±4.1）歲。納入標準：（1）志愿者知情同意并簽署倫理同意書；（2）3 個月內未使用抗生素；（3）實驗2 周內血常規(guī)：白細胞（4.0 ～10.0）×109/L，血小板（100 ～300）×109/L。排除標準：（1）合并嚴重心肝腎功能障礙；（2）合并血液系統(tǒng)相關疾病。

1.3 實驗方法

1.3.1 PRP、PPP 與PG 的制備 每位志愿者均抽取外周靜脈血25mL。全血經兩次差速離心獲得PRP與PPP（platelet-poor plasma，貧血小板血漿），兩次離心的條件[6]分別為：20℃，1500r/min、時間10min和3200r/min、時間8min。將凝血酶凍干粉溶于10% CaCl2制成終濃度1000U/mL 凝血酶-CaCl2激活劑，與PRP 以1 ∶10 混合制成PG。

1.3.2 體外抑菌實驗

1.3.2.1 轉菌 本實驗在佛山市中醫(yī)院臨床實驗室嚴格無菌下進行。MRSA 菌株接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37.0℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

1.3.2.2 配管 將1mL 菌株接種至含4mL PBS 的無菌試管中，充分混懸。以0.5 麥氏單位比濁致終濃度為1.0×106cfu/mL，取5 支無菌干燥試管注入0.1mL 菌液。分別取制備的PRP、PPP、PG 及全血、PBS 注入此5 支試管內，并以注入的成分命名分組。PRP 組注入0.5mL PRP 和0.4mL PBS，PPP 組注入0.5mL PPP 和0.4mL PBS，PG 組加入0.55mL PG 和0.35mL PBS，全血組加入0.5mL 含抗凝劑全血和0.4mL PBS，PBS 組（對照組）加入0.9mL PBS。

1.4 觀察指標

（1）用血細胞分析儀檢測PRP、PPP 及全血的白細胞、血小板含量。（2）菌落計數(shù)：五組試管置入37℃恒溫箱中孵育，間隔0、2、4、6、8、12、24h 分別 取0.1mL 樣 本，用0.9mL PBS 做3 次l ∶10 系列稀釋，取100μL 樣本點種于血瓊脂平板后，置37.0℃恒溫箱培養(yǎng)24h，最后計數(shù)菌落數(shù)。所獲數(shù)據(jù)用時間-菌落濃度曲線圖表示。（3）抑菌率。抑菌率[7]＝（對照組平均菌落數(shù)-實驗組平均菌落數(shù)）/對照組平均菌落數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以（）表示；由于菌落計數(shù)不成正態(tài)分布，因此取其對數(shù)轉化使之基本符合正態(tài)分布。白細胞和血小板計數(shù)、抑菌率的組間比較采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義；P ＜0.01為差異有高度統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白細胞及血小板含量計數(shù)

全血中白細胞與血小板含量計數(shù)分別為（6.642±1.288）×109/L 和（183.816±43.004）×109/L。所得的PRP 中分別為（16.018±3.224）×109/L 和（1013.142±155.822）×109/L，與全血比較白細胞含量計數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；所 得 的PPP 中 分 別 為（0.416±0.208）×109/L 和（19.223±4.038）×109/L，與全血比較差異均有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見表1。

2.2 各組各時間點的MRSA菌落計數(shù)

各組在不同時間點對MRSA 的菌落濃度計數(shù)結果如圖1 所示。培育開始階段，PRP 組、PG 組的菌落

表1 二次離心后取PRP、PPP及全血的白細胞、血小板含量（，×109/L）

表1 二次離心后取PRP、PPP及全血的白細胞、血小板含量（，×109/L）

白細胞含量 血小板含量組別PRP組 PPP組 PRP組 PPP組PRP/PPP組 16.018±3.224 0.416±0.208 1013.142±155.822 19.223±4.038全血組 6.642±1.288 183.816±43.004 t 18.112 22.524 25.104 18.724 P ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 PRP組與PG組在不同時間對MRSA的抑菌率比較，%）

表2 PRP組與PG組在不同時間對MRSA的抑菌率比較，%）

組別 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P PRP組 14.493±1.813 29.630±4.587 25.882±2.787 15.294±1.508 12.791±4.192 7.865±3.821 149.780 ＜0.01 PG組 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 9.532 8.842 7.449 5.679 1.890 1.922 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

表3 PPP組與PG組在不同時間對MRSA的抑菌率比較，%）

表3 PPP組與PG組在不同時間對MRSA的抑菌率比較，%）

組別 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P PPP組 5.797±1.432 2.469±0.754 4.706±0.622 2.353±0.338 2.326±0.527 1.124±0.435 122.898 ＜0.01 PG組 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 17.296 26.438 24.029 17.119 11.547 7.286 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 全血組與PG組在不同時間對MRSA的抑菌率比較，%）

表4 全血組與PG組在不同時間對MRSA的抑菌率比較，%）

組別 2h 4h 6h 8h 12h 24h F P全血組 7.246±1.225 16.049±2.724 17.647±1.912 9.412±1.688 3.488±1.323 3.371±1.128 293.568 ＜0.01 PG組 26.087±3.803 41.975±5.121 37.647±4.708 22.353±4.033 15.116±3.822 11.236±4.788 182.744 ＜0.01 t 16.335 15.483 13.634 10.253 9.959 5.538 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

濃度呈現(xiàn)呈現(xiàn)先下降后上述趨勢，至4h 達到最低點，此時間點的菌落計數(shù)最少，抗菌效果最明顯，隨后菌落濃度開始上升，兩組組均至12h 后菌落濃度上升趨勢進入相對平穩(wěn)期。PPP 組與PBS 組的菌落濃度在培育開始階段即呈對數(shù)上升趨勢，全血組成緩慢上升趨勢，此三組菌落濃度同樣于12h 后趨向于平穩(wěn)。上述說明菌落計數(shù)有隨時間變化趨勢呈負相關。含有高濃度血小板的組別（PRP 組、PG 組）的菌落計數(shù)在各時間點均低于另外三個組別（全血組、PPP 組、PBS 組），即含有高濃度PRP 組具有抗菌性。且PG 組與PRP 組的對比中，12h 內PG 的抗菌性優(yōu)于PRP，12h 后PG 組與PRP 組細菌生長趨向穩(wěn)定。

圖1 不同時間點對MRSA 的菌落濃度曲線圖

2.3 各組對MRSA的抑菌率

含 有 高 濃 度PRP 的 組 別（PG 組、PRP 組）對MRSA 的 抑 菌 率 在12h 內 明 顯，并 在4h 時抑菌率最強；其中PG 組平均抑菌率達到了（41.975±5.121）%，與PRP 組的（29.630±4.587）%比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），與其他三組比較差異均有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。4h后含有高濃度PRP 的兩組的抑菌率均逐漸降到最低狀態(tài)。含有高濃度PRP 的PG 組、PRP 組的抑菌作用始終依次高于全血組、PPP 組，并在12h 內抑菌率差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見表2 ～4。

3 討論

基于富血小板血漿（PRP）含有多種高濃度的生長因子，近年國內將此生物療法技術廣泛應用于普通外科、骨科、燒傷整形科等多個學科領域。隨著應用的開展，漸多的文獻報道[8-9]PRP 可能具有抑菌活性，這與筆者臨床應用PRP 修復慢性創(chuàng)面的臨床觀察結果一致。

筆者觀察到在本實驗結果中，PRP 的血小板含量約為全血的5.5 倍，白細胞含量為全血的2.4 倍，理論上是有一定的抑菌作用的，同時抑菌率數(shù)據(jù)顯示其與血小板濃度呈正相關性。白細胞中的中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞，是已被確認的在人防御機制中發(fā)揮了重要的作用。白細胞在PRP 的制備過程中大部分沒有被破壞，其重要的抗病原體活性得以保持[10]。髓過氧化酶（MPO）存在于中心粒細胞中，其被病原體等激活和脫顆粒后，生成具有高度殺菌活性的次氯酸和活性氧衍生物，對病原體進行殺傷；同時中心粒細胞內為含有多種水解酶的溶酶體，具有消化病原體及異物的作用。單核細胞進入組織后轉化為可以吞噬致病物質的巨噬細胞，并催化產生活性氧代謝物，殺滅病原體[11]。而淋巴細胞則通過免疫應答作用來發(fā)揮抑菌作用。血小板是PRP 中含量最豐富的細胞成分，早在1992年Yeaman 等[12]就發(fā)現(xiàn)它具備抑菌活性，報道顯示血小板可在體外直接黏附和清除細菌、真菌，同樣也能增強血液中病原微生物的清除率。另一研究發(fā)現(xiàn)[13]，血小板激活后除了可釋放大量生長因子加速軟組織修復外，同時具有與中性粒細胞等共同的結構和功能，如lgG 的Fe 受體、CD36 抗原等受體。激活后的血小板，其表面的受體能促進吞噬細胞對病原體的內化作用；血小板亦可產生過氧化物、羥基自由基和過氧化氫等抑菌氧化代謝產物，直接黏附和內化病原體。血小板裂解后能釋放有效的抗菌肽，大多數(shù)研究認為抗菌肽是血小板的主要抗菌因子，具有直接抗菌作用。Tang 等[14]證實了這一點，其研究顯示血小板激活后可釋放7 中抗菌肽，并表明其具有直接的抗菌特性。另外，血小板堿性蛋白已被證實除了作為CXC 趨化因子的信號作用，還有對抗病原體的作用[11]。基于PRP 的抑菌活性，學者開始探討PRP 對病原菌的抑菌實驗作用。趙連前等[15]報道了不同血小板濃度的富血小板凝膠具有抑制金黃色葡萄球菌的作用。

筆者結合本實驗結果，觀察到含有高濃度PRP的PG 組、PRP 組的菌落計數(shù)在各時間點均低于另外三個組別，發(fā)現(xiàn)PRP 的抑菌作用隨血小板的濃度增加而增加，可能由于抗菌肽的釋放越多，抑菌作用越強，這說明PRP 抑菌作用具有濃度依賴性。PG 組、PRP 組對MRSA 的抑菌作用在12h 內明顯，并以第4h 最強，12h 后逐漸減弱，可能由于抗菌肽的消耗，抑菌作用減弱，細菌呈現(xiàn)對數(shù)繁殖，這表明PRP 抑菌作用具有時效性。筆者另觀察到，PG 組的菌落計數(shù)亦低于高于PRP 組，考慮PRP 組中的未加入凝血酶，抑菌成分未完全釋放，故在本實驗中抑菌作用較PG 低。PPP 組僅含有極少量的血小板與白細胞，故其與對照組（PBS 組）相仿，基本不呈現(xiàn)抑菌活性。全血組中的白細胞與血小板量介于PRP 組與PPP 組之間，考慮白細胞作用與血小板釋放一定量的抑菌成分相關，菌落濃度曲線圖結果呈現(xiàn)符合此中界結果。

本實驗有關PRP 的抑菌作用、時效性的結果與筆者臨床中運用PRP/PG 修復慢性創(chuàng)面的臨床觀察結果基本吻合。筆者臨床中觀察中慢性褥瘡創(chuàng)面運用PRP/PG 除了其創(chuàng)面體積明顯縮小以外，使用PRP/PG 的24h 內創(chuàng)面周圍紅腫熱癥狀較術前改善，且整個治療周期中，創(chuàng)面滲出量、滲出液性質均較未使用PRP 時期好轉，故筆者在實際病例中減少了使用抗菌藥物輔助治療。由此，筆者進一步認為在慢性創(chuàng)面中PRP 與使用抗菌藥物相比更具優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在以下5 個方面：（1）PRP 在促進組織修復的過程中發(fā)揮的抑菌作用，這均屬于PRP 的自身功能，兩者可能存在協(xié)同的作用；（2）PRP 發(fā)揮抑菌作用的機制有別于抗菌藥物，故病原微生物產生耐藥性的可能性極低；（3）基于PRP 具有抑菌作用，可探討減少使用抗菌藥物的時長、劑量，甚至降級使用抗菌藥物的可能性；（4）PRP 在創(chuàng)面形成PG 黏附于創(chuàng)面表面，可一定程度上阻礙病原微生物進入創(chuàng)面，減少病原微生物的新增量；（5）PRP 源于自身血液提取獲得，可避免過敏反應、排斥反應及傳染性疾病的發(fā)生。

目前，PRP 主要用于軟組織的修復方面，隨著更多研究抑菌作用的證實，其也逐漸用于感染創(chuàng)面的處理，張宏亮等[16]報道PRP 與NPWT 聯(lián)合應用于難治性感染創(chuàng)面具有較好的抑菌效果，能夠提高機體EPO 水平，促進傷口愈合。由此，筆者認為可進一步探討PRP 的抑菌作用作為傳統(tǒng)使用抗菌藥物的一種有效補充，作為預防和治療例如關節(jié)感染、慢性創(chuàng)面感染等PRP 治療領域的一種補充手段。但由于時間及條件的限制，本實驗研究仍存在一定的不足之處，如本實驗對象是健康人群、使用的是外購的MRSA 標準菌株，與合并多種慢性疾病的人群、與臨床分離菌株、創(chuàng)面多種菌群存在的復雜情況存在差異，下一步筆者將選取臨床患者或更多的菌群進一步探討PRP 的抑菌作用及臨床應用來加以佐證。