基于轉錄組測序技術研究川芎嗪對急性脊髓損傷模型大鼠基因表達的影響

張毅　祁文　吳迪　謝旻成

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）11-1327-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.08

摘 要 目的：探討川芎嗪對急性脊髓損傷（SCI）模型大鼠基因表達的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機分為假手術組（A組，6只），模型組（B組，不同時間點各6只，共12只）和川芎嗪干預組（C組，不同時間點各6只，共12只）。B、C組大鼠參照改良Allens法復制急性SCI模型。造模后，C組大鼠腹腔注射川芎嗪100 mg/kg，A、B組大鼠腹腔注射等容生理鹽水，每日1次，持續7 d或14 d（分別記為B7 d、B14 d組和C7 d、C14 d組）。分別于造模前和造模后7、14 d對各組大鼠進行BBB評分，并行脊髓標本蘇木精-伊紅、尼氏染色觀察;采用轉錄組測序技術分析A組與B組、B組與C組大鼠脊髓標本中的差異表達基因（DEGs），借助基因本體（GO）數據庫和KEGG數據庫進行GO和KEGG信號通路富集分析。結果：與A組比較，B組大鼠造模后7、14 d的BBB評分均顯著降低（P<0.05），其脊髓組織中的神經細胞和尼氏體數量明顯減少;與B組比較，C組大鼠上述時間點的BBB評分均顯著升高（P<0.05），其脊髓組織中的神經細胞和尼氏體數量有所增多。A組和B7 d組、A組和B14 d組、B7 d組和C7 d組、B14 d組和C14 d組大鼠的DEGs分別有886、1 404、70、66個，組間表達變化趨勢相反的基因包括Ncmap、Prx、Gabrq、Gabrg2等。各組間DEGs富集的細胞部位、分子功能、生物學過程各有不同，主要涉及溶泡、溶酶體、質膜部分、同型蛋白結合、免疫應答、離子通道活性、免疫反應（A組和B組），基底外側質膜、外脫氧核糖核酸酶活性、對干擾素γ的反應（B7 d組和C7 d組），以及細胞外區、受體調節活性、含酚化合物代謝過程（B14 d組和C14 d組）等;同時，DEGs富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用（A組和B組），細胞黏附分子、補體和凝血級聯、Hedgehog信號通路（B7 d組和C7 d組），逆行內源性大麻素信號、神經活性配體-受體相互作用、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、γ-氨基丁酸（GABA）能突觸（B14 d組和C14 d組）等信號通路。結論：川芎嗪對急性SCI模型大鼠的保護作用可能與其參與炎癥反應、免疫應答/調節、離子通道、細胞因子-細胞因子受體相互作用、神經活性配體-受體相互作用、GABA能突觸活性調節等有關。

關鍵詞 川芎嗪;急性脊髓損傷;轉錄組測序技術;差異表達基因;基因本體;KEGG信號通路;機制;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of ligustrazine on gene expression of acute spinal cord injury （SCI） model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into sham operation group （group A， 6 rats）， model group （group B， 6 rats at each time point， 12 rats in total） and ligustrazine intervention group （group C， 6 rats at each time point， 12 rats in total）. Acute SCI model was established by modified Allens method in group B and C. After modeling， group C was given ligustrazine 100 mg/kg intraperitoneally， while group A and B were given constant volume of normal saline intraperitoneally， once a day， for consecutive 7 d or 14 d （i.e. group B7 d and B14 d， group C7 d and C14 d）. BBB scoring was conducted in each group before modeling， 7 and 14 days after modeling. HE and Nissl staining observation were also carried out for spinal cord specimen. The differentially expressed genes （DEGs） between group A and group B， group B and group C were analyzed by transcriptome sequencing. The enrichment of Gene Ontology （GO） and KEGG signaling pathway was analyzed by GO database and KEGG database. RESULTS： Compared with group A， BBB scores of group B were decreased significantly 7 d and 14 d after modeling （P<0.05）， and the number of nerve cells and Nissl body in spinal cord tissue were decreased. Compared with group B， BBB scores of group C were increased significantly at above time points （P<0.05）， and the number of nerve cells and Nissl body in spinal cord tissue were increased. The numbers of DEGs of group A and group B7 d， group A and group B14 d， group B7 d and group C7 d， group B14 d and group C14 d? were 886， 1 404， 70， 66， respectively. The genes with opposite expression trend included Ncmap， Prx， Gabrq， Gabrg2， etc. The enrichment cell component， molecular function， biological process of DEGs were different in each group， mainly involving lyocytosis， lysosome， plasma membrane， homotype protein binding， immune response， ion channel activity， immune response （group A and B）; basolateral plasma membrane， exodeoxyribonuclease activity， response to INF-γ （group B7 d and C7 d）; extracellular domain， receptor regulatory activity， phenolic compound metabolism process （group B14 d and C14 d）. DEGs enriched in cytokine-cytokine receptor interaction （group A and B）; CAMs， complement and coagulation cascades and Hedgehog signaling pathway （group B7 d and C7 d）; retrograde endocannabinoid signaling， neuroactive ligand-receptor interaction， PPAR signaling pathway， GABA ergic synapse （group B14 d and C14 d）， etc. CONCLUSIONS： Protective effect of ligustrazine on acute SCI model rats may be associated with inflammatory response， immune response/regulation， neuron ion channel， cytokine-cytokine receptor interaction， neuroactive ligand-receptor interaction and regulation of GABA ergic synapse activity.

KEYWORDS? ?Ligustrazine; Acute spinal cord injury; Transcriptome sequencing; Differentially expressed gene; Gene Ontology; KEGG signaling pathway; Mechanism; Rats

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）是一種因高能量損傷而導致的嚴重性致殘性疾病。在全世界范圍內，由于收集數據的方式以及結果推算的技術不同，不同地區SCI的發病率差別很大，從236/100萬到4 187/100萬不等[1]。最近的一項二次研究顯示，我國SCI每年的發病率約為37/100萬[2]。SCI在中醫上屬于“體惰”“癱證”“痿躄”范疇，為督脈損傷所導致的其他經絡、氣血、臟腑功能障礙[3]。近年來，中醫藥治療SCI的相關研究有所增多。川芎嗪（即四甲基吡嗪）是從中藥川芎中分離出的一種生物堿，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、改善微循環等作用，臨床上多用于治療各種缺血再灌注損傷[4-5]。SCI的原發性損傷大多不可逆，繼發性損傷則是緊接原發性損傷之后的由類似于“雪崩式”損傷激活的自身損傷過程，包括缺血、出血、脊髓休克、水電解質紊亂、自由基增多、一氧化氮改變等，可引起持續性的細胞損害，甚至可引發神經細胞凋亡[6-7]。近年來，學者對SCI的研究逐漸轉向多基因參與、復雜網絡調控等分子水平發展。轉錄組測序是當前最有效的高通量技術，可快速檢測和發現細胞或器官在特定條件下所有基因、功能基因及其轉錄的調控規律[8]。基于此，本研究在動物實驗的基礎上，借助轉錄組測序技術分析川芎嗪干預急性SCI模型大鼠基因表達的影響并尋找差異表達基因（DEGs），并對其進行基因本體（GO）和KEGG信號通路富集分析，以期為進一步探索川芎嗪治療SCI的分子機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2100型生物分析儀（美國Agilent公司）;Hiseq X-ten型高通量轉錄組測序儀（美國Illumina公司）;CK31型正置光學顯微鏡（日本Olympus公司）;TVO 63XC-MO型顯微數碼成像系統（廣州市明美光電技術有限公司）;Pannoramic SCAN型數字全掃儀器（匈牙利3DHISTECH公司）;ImpactorModelⅠ型打擊儀（安徽正華生物儀器設備有限公司）;KD-BM型包埋機、KD-2258型病理切片機、KD-P型攤片機、KD-BL型冷凍臺（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）;PHG-9070A型烤箱（上海精宏實驗設備有限公司）;JJ124BC型分析天平（常熟雙杰測試儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸川芎嗪（北京四環科寶制藥有限公司，批號：18110345，規格：80 mg;臨床用量：80～120 mg/次，每日1次）;氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批號：A18122701-1，規格：500 mL ∶ 4.5 g，作生理鹽水用）;注射用青霉素（山東圣旺藥業股份有限公司，批號：20180301，規格：167萬單位）;Ambion Trizol試劑盒（美國Life Technologies公司，批號：15596018）;多聚甲醛（美國Sigma公司）;尼氏體染色液（北京索萊寶科技有限公司）;蘇木精-伊紅（HE）染色液、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.0）均為本實驗室自制;無水乙醇、二甲苯等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠30只，雄性，6～8周齡，體質量200～230 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產合格證號：SCXK（湘）2016-0002。所有動物均單籠飼養，環境溫度為20～28 ℃。

2 方法

2.1 造模

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為假手術組（A組，6只）、模型組（B組，共12只;不同時間點各6只，分別記為B7 d、B14 d組）和川芎嗪干預組（C組，共12只;不同時間點各6只，分別記為C7 d、C14 d組）。禁食、不禁水8 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3 mg/kg）麻醉，以第9胸椎（T9）為中心，咬除椎板，暴露長約5 mm的脊髓。A組大鼠止血縫合;B、C組大鼠利用打擊儀參照改良Allens法復制急性SCI模型：以棘突固定器鉗夾固定胸椎T8、T10棘突，調節T9節段脊髓水平，用直徑2.5 mm、質量10 g的撞針自2.5 cm高處自由落下垂直撞擊T9脊髓后正中部（致傷能量：25 gcf），撞擊后迅速移除撞針。以肉眼可見脊髓組織腫脹、出血以及大鼠擺尾反射、雙下肢回縮樣撲動且麻醉清醒后呈遲緩性癱瘓為造模成功[9]，縫合術后皮下注射青霉素8萬單位，每日1次、持續3 d。人工按摩大鼠膀胱排尿，每日2次，直至其恢復自主排尿。

2.2 給藥

造模成功后，C組大鼠腹腔注射川芎嗪（藥液質量濃度為10 mg/mL，以生理鹽水配制;給藥量為100 mg/kg，劑量根據該藥臨床用量并按人與動物體表面積換算而得），A、B組大鼠均腹腔注射等容生理鹽水。首次給藥應在術后30 min內，每日1次，分別持續7 d或14 d。

2.3 大鼠神經功能行為學觀察及評分

分別于造模前和造模后7、14 d時對各組大鼠進行BBB評分：將大鼠放入開口圓盆中，使其自由直線行走，盡量令其在盆內的中心區域活動。測試時間為4 min，觀察大鼠在行走過程中膝、髖和踝關節的運動幅度、軀干運動和協調情況并計分;總分為21分，分數高低與大鼠SCI程度呈反比[10]。評分由兩位研究者獨立完成，取平均值作為評分結果。

2.4 標本的采集與指標檢測

2.4.1 標本的采集 分別于造模后7、14 d時取B、C組大鼠各6只，于造模后14 d時取A組大鼠6只，均于耳緣靜脈注射30 g/L戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉后，于左心室灌注生理鹽水約30 mL，再用4%多聚甲醛溶液30 mL灌注至肢體強直，以脊髓受損處（A組大鼠于對應位置）為中心，取出上下各長約0.5 cm的脊髓，備用。

2.4.2 HE、尼氏染色觀察 每組在相應時間點取3只大鼠的脊髓標本適量，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，次日經常規脫水、透明、石蠟包埋后切片（厚度約4? ? ? ? ?μm）。切片分別經HE、尼氏染色后，置于顯微鏡下觀察并拍照，記錄大鼠脊髓損傷及恢復情況[經HE染色后，神經細胞的細胞質呈紅色，細胞核呈藍紫色;經尼氏染色后，尼氏體呈塊狀（如虎斑狀）或顆粒狀]。

2.4.3 DEGs分析 每組在相應時間點取另外3只大鼠的脊髓標本適量，采用Ambion Trizol試劑盒提取總RNA，選擇質量合格[即經生物分析儀檢測，RNA完整值（RIN）≥7;28S/18S≥1.5，且起始量為0.1～1 μg][11]的總RNA作為mRNA測序的建庫起始樣品，經mRNA純化及片段化、cDNA合成、文庫片段富集、文庫質檢后，采用二代轉錄組測序技術以高通量轉錄組測序儀對上述文庫進行雙末端（PE）測序。使用Cutadapt v1.15軟件對原始數據進行處理，去除3′端帶接頭的序列、平均質量分數低于Q20的序列，以保證測序錯誤率<1%;使用FastQC v0.11.8軟件對測序數據進行單堿基質量分布、含量分布、Reads值平均質量分布檢測，以評估測序數據的質量;使用HISAT 2.0軟件將過濾后的Reads值與Ensembl數據庫（http：//www.ensembl.org/）中的參考基因組（共有基因22 250個）進行對比。根據比對結果，使用HTSeq v0.11.1軟件統計各比對基因的Reads值，并將該值作為此基因的原始表達量。使用FPKM（Fragments per kilobase million，即在每百萬個Reads值中，來自某基因每千個堿基長度的Reads值）對表達量進行標準化，使用RSeQC v2.6.4軟件分析表達量飽和度，并以Pearson相關系數表示樣本間基因表達模式的相關性，并制作成熱圖（重復樣本間的相關系數越接近于1，表明相關性越強[12]）。在此基礎上，對不同樣本進行表達分析，采用DESeq V3.10軟件對各組基因表達量（以經FRKM進行標準化的Reads值表示）進行差異分析，以表達差異倍數log2FC>1且P<0.05的基因為DEGs[13-14]，并繪制各組間共有、特有DEGs的Upset圖。

2.5 生物學分析

以“2.4”項下所得DEGs為對象，借助GO數據庫（http：//geneontology.org/）中的“topGO”插件進行GO富集分析，挖掘DEGs涉及的生物學過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）;借助KEGG數據庫（http：//www.kegg.jp/）進行KEGG通路富集分析，挖掘DEGs富集的主要信號通路。兩者均以P<0.05為顯著富集。

2.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠BBB評分結果

造模前，各組大鼠的BBB評分均為21分。與A組比較，B組大鼠造模后7、14 d時的BBB評分均顯著降低;與B組比較，C組大鼠造模后7、14 d時的BBB評分均顯著升高（P<0.05），詳見表1。

3.2 HE、尼氏染色觀察結果

經HE染色后，A組大鼠脊髓神經細胞形態正常，胞核清晰可見;B組大鼠脊髓神經細胞核固縮，且數量明顯減少;C組大鼠脊髓神經細胞破損程度較同一時間點的B組要輕，詳見圖1A。經尼氏染色后，A組大鼠尼氏體呈塊狀（形如虎斑）或顆粒狀;B組大鼠尼氏體染色變淺，數量明顯減少，在7 d時幾乎消失;C組大鼠尼氏體的數量較同一時間點的B組明顯增多，詳見圖1B。

3.3 DEGs分析結果

測序所得數據的質量檢測結果顯示，大部分序列的堿基質量均在Q20以上，未出現堿基偏移;中等表達的基因占大多數，而低表達、高表達的基因占比較小，見圖2[圖中，A、B、C分別對應A、B、C組，數字對應各組大鼠序號，“7 d”“14 d”分別表示造模后7 d、造模后14 d（下同）;盒型中間的橫線是中位數，盒型的上下邊緣為75%lgFRKM，上下限為90%lgFRKM];樣本間基因表達模式的Pearson相關系數均大于0.8，提示各樣本選擇合理、生物重復性較好，見圖3（圖中，左側和上側為樣本聚類情況，方塊中的數據為Pearson相關系數）。

在此基礎上，對各組間的DEGs進行篩選，各組差異分析共有、特有DEGs的Upser圖見圖4（圖中，“number in each set”表示各組鑒定到的差異基因的總數，“number of each intersection”表示多個比較組鑒定到的共有差異基因的數目;橫坐標的單一“·”表示該組鑒定到的特有差異基因的數目，橫坐標多個“·”之間的連線所對應的“number of each intersection”表示連線連接的多個比較組鑒定到的共有差異基因的數目）。結果，A組和B7 d組、A組和B14 d組、B7 d組和C7 d組、B14 d組和C14 d組大鼠比較，分別涉及DEGs 886、1 404、70、66個，詳見表2;涉及Ncmap、Prx、Gabrq、Gabrg2等基因，部分DEGs篩選結果見表3。

3.4 生物信息學分析

由于生物過程條目眾多，故本研究根據P值大小將排序前10位的GO富集結果進行展示，詳見圖5（圖中，CC為細胞部位，MF為分子功能，BP為生物過程;MHC為主要組織相容性復合體，LUBAC為線性泛素裝配復合體，IFN-γ為γ干擾素，CRLF為細胞因子受體樣因子，CLCF1為心肌營養素樣細胞因子1，CNTFR為睫狀神經營養因子受體，GABA為γ-氨基丁酸）。根據FDR值（FDR即未發現率，一般取值范圍為0～1，越接近于零則表示富集越顯著[15]）大小將排序前20位的KEGG富集結果（P<0.05）進行展示，詳見圖6（圖中，HLTV-1為人類嗜T淋巴細胞病毒1，CAMs為細胞黏附因子，TNF為腫瘤壞死因子，FoxO為叉頭框蛋白O，PPAR為過氧化物酶體增殖物激活受體）。

3.4.1 A組與B組 GO富集分析結果（圖5A、5B）顯示，A、B組DEGs富集的BP主要與免疫系統過程、生物過程調節、應激反應、細胞激活等有關，具體包括免疫應答、防御反應、對細胞因子的反應等。兩組DEGs富集的CC主要為細胞外區、細胞膜、細胞表面等部位，還涉及到MHC蛋白復合物、炎癥復合物（A組vs. B7 d組）和受體復合物（A組vs. B14 d組）、溶酶體（A組vs. B組）等。在MF中，兩組DEGs均富集于結合，包括蛋白質結合、陰離子結合、陰離子配位等，同時還涉及半胱氨酸型內肽酶活性、細胞因子受體結合、趨化因子受體結合等受體結合（A組vs. B7 d組）以及被動跨膜轉運蛋白活性、底物比通道活性等轉運活性（A組vs. B14 d組）。KEGG富集分析結果（圖6A、6B）顯示，A、B組的DEGs主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、CAMs、吞噬體、類固醇生物合成、抗原處理和呈遞、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、補體和凝血級聯等信號通路上。

3.4.2 B組與C組 ①B7 d組與C7 d組：GO富集分析結果（圖5C）顯示，兩組DEGs主要富集于與免疫應答、神經元保護、有機酸轉運等BP上，主要包括對IFN-γ的反應、電壓門控鈉離子通道的聚集、髓鞘形成、神經鞘、神經元離子通道聚集、固有免疫應答、羧酸跨膜轉運等。DEGs主要富集的CC包括基底外側質膜、質膜區、刷狀緣等部位，主要具有外脫氧核糖核酸酶活性、二羧酸跨膜轉運蛋白活性、鈣離子結合等MF。KEGG富集分析結果（圖6C）顯示，兩組的DEGs主要富集于CAMs、補體和凝血級聯、Hedgehog信號通路等信號通路上。②B14 d組與C14 d組：GO富集分析結果（圖5D）顯示，兩組DEGs富集的BP主要與含酚化合物代謝過程、細胞對內源性刺激的反應等有關，包括對兒茶酚類化合物代謝過程、對氮化合物的反應、有機氮化合物的細胞反應等。DEGs主要富集于細胞外區、細胞外間隙、頂體內膜、頂體外膜等部位，涉及CRLF-CLCF1復合體、CNTFR-CLCF1絡合物、GABA受體復合體、GABA-A受體復合物等;主要涉及受體調節活性、G蛋白α亞單位結合、DNA核苷酸轉移酶活性等MF。KEGG富集分析結果（圖6D）顯示，兩組DEGs主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、逆行內源性大麻素信號轉導、神經活性配體-受體相互作用、PPAR信號通路、GABA能突觸、FoxO信號通路、多巴胺能突觸等信號通路上。

4 討論

SCI在臨床上較為常見且治療棘手，且由于該癥高發病率、高致殘率、高耗費和青壯年多發的特點，給患者及其家庭乃至整個社會都造成了極大的負擔[1-2]。DEGs及其mRNA一直是近十幾年來研究的熱點之一，以其為基礎開展靶向治療、精準治療研究，可為SCI的臨床治療提供新的方向。本研究基于二代測序基礎，初步探討了川芎嗪對急性SCI模型大鼠脊髓組織中DEGs的影響，并對DEGs進行GO和KEGG富集分析，旨在為川芎嗪治療SCI的深入研究提供參考。

4.1 A組與B組比較結果的分析

與A組比較，B組大鼠造模后7、14 d時的BBB評分均顯著降低，且脊髓神經細胞和尼氏體的數量均明顯減少。兩組共涉及DEGs 886個（A組和B7 d組）、1 404個（A組和B14 d組）。GO富集、KEGG信號通路富集分析結果顯示，兩組DEGs主要富集于細胞表面、胞外區部分、溶泡、溶酶體、質膜部分等CC，涉及蛋白質結合、細胞因子結合、陰離子結合/配位等MF以及免疫系統過程、免疫反應、免疫應答、防御反應等BP，主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、CAMs、吞噬體等信號通路，與脊髓損傷相關機制和病理生理過程（如免疫性損傷、缺血再灌注損傷、脂質過氧化）[6-7]基本相符。

4.2 B組與C組比較結果的分析

與B組比較，C組大鼠造模后7、14 d時的BBB評分均顯著升高，且脊髓神經細胞和尼氏體的數量均有所增多。兩組共涉及DEGs 70個（B7 d組和C7 d組）、66個（B14 d組和C14 d組）。

4.2.1 B7 d組和C7 d組 DEGs分析結果顯示，在A組和B7 d組表達下調而在B7 d組和C7 d組表達上調的DEGs有Ncmap、Prx、Ddn等，主要與髓鞘形成、神經元發育和突觸可塑性有關[7]。GO、KEGG富集分析結果顯示，兩組DEGs主要富集于基底外側質膜、質膜區、刷狀緣等CC，主要涉及外脫氧核糖核酸酶活性、二羧酸跨膜轉運蛋白活性、運載受體活性等MF，對IFN、IFN-γ的反應、電壓門控鈉離子通道的聚集、髓鞘形成、神經元離子通道聚集、有機酸轉運等BP以及CAMs、補體和凝血級聯反應、Hedgehog信號通路等信號通路。

有研究表明，應用鈉離子通道阻滯劑、早期開放低電導鈣依賴性鉀通道、激活磷酸三腺苷敏感性鉀通道（KATP）、阻斷鉀離子過度外流/阻斷細胞內鈣超載等均對神經損傷具有一定的改善作用;而激活延遲外向鉀通道、高電導鈣依賴性鉀通道等則可對神經細胞造成損傷[16-18];同時，鈉離子通道各亞型均參與了炎性疼痛和神經性疼痛的發生[19]。細胞免疫、體液免疫都受IFN-γ的調節：有研究指出，1型輔助T細胞（Th1）和小膠質/巨噬細胞分泌的IFN-γ依賴性白細胞介素10（IL-10）有助于SCI后的功能恢復[20]。補體和凝血級聯在機體止血、免疫防御等方面具有非常重要的作用：有研究指出，在外周神經損傷誘發的神經疼痛模型大鼠中，其脊髓背角存在補體的異常活化，且干預該活化過程可明顯抑制或者逆轉其痛覺過敏[21]。脫氧核糖核酸酶在細胞凋亡、DNA降解等中起著重要作用[22]。此外，CAMs的作用也不能忽視：有研究認為，急性SCI患者的外周血淋巴細胞中細胞間黏附分子1（ICAM-1）含量升高，該分子可能參與了患者機體的免疫應答及SCI發生過程[23];神經細胞黏附分子（NCAM）是細胞外基質的重要組分，參與了中樞神經的分化、遷移、發芽、突觸重建等過程[24-25]，有研究者于蛛網膜下腔注射重組人神經細胞黏附分子1（rhNCAM-1）蛋白后，患者雙下肢運動功能有所恢復，提示該藥可通過改善SCI后損傷區及其兩端神經細胞之間的功能來促進軸突再生，從而促進患者運動功能恢復[26]。Hedgehog信號通路與神經發育、分化過程以及神經炎癥、神經性疼痛有關，可能參與了SCI后的神經修復調控[27-29]。由此可見，造模后7 d，川芎嗪對模型組大鼠的保護作用可能與其參與免疫應答、炎癥反應、離子通道聚集、髓鞘形成、CAMs、補體和凝血級聯反應等有關。

4.2.2 B14 d組和C14 d組 DEGs分析結果顯示，在A組和B14 d組表達下調而在B14 d組和C14 d組表達上調的DEGs有Gabrq、Gabrg2等，主要與GABA能突觸有關[30]。GO富集、KEGG信號通路富集分析結果顯示，兩組DEGs主要富集于細胞外區、頂體內/外膜等部位，主要涉及受體調節活性、G蛋白α亞單位結合、DNA核苷酸轉移酶活性等MF，含酚化合物代謝過程、細胞對氮化合物的反應、內源性刺激的細胞反應等BP以及細胞因子-細胞因子受體相互作用、逆行內源性大麻素信號轉導、神經活性配體-受體相互作用、PPAR信號通路、GABA能突觸、FoxO信號通路、多巴胺能突觸等信號通路。

GABA是中樞神經系統中一種重要的神經遞質，其對神經元抑制作用的發揮主要是由GABA-A受體來完成的[30]。GABA-A受體的再分配由多種神經調節物質（如激素和細胞因子）介導[31]。有研究發現，TNF-α增加了神經突觸上GABA-A受體的數量，該炎癥因子介導的GABA-A受體向脊髓神經元質膜轉運是中樞神經興奮性毒性的一個潛在靶點[32]。有研究指出，GABA可降低SCI七鰓鰻幼蟲和非SCI七鰓鰻幼蟲的彎曲反應;GABA-A受體拮抗劑能增強SCI七鰓鰻幼蟲的彎曲反應，同時GABA能效應受其SCI恢復程度的影響[33]。有學者以部分坐骨神經結扎大鼠模型為研究對象，發現經脊髓刺激后誘導的鎮痛與局部GABA能神經遞質系統的激活有關[34]。唾液α-淀粉酶可反映交感神經系統活性[35];同時，副交感神經活動、反射活動或SCI下受體超敏反應等也可能導致運動后唾液α-淀粉酶活性的變化[36]。有研究者從不同角度探討去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類神經遞質與免疫系統之間的相互作用，發現下丘腦、海馬和外周淋巴器官中兒茶酚胺的含量與免疫系統功能密切相關[37-38];其他的如PPAR信號通路、FoxO信號通路雖未見與急性SCI直接相關的證據，但均與氧化應激損傷、細胞凋亡等有關[39-40]。由此可見，造模后14 d，川芎嗪對模型組大鼠的保護作用可能與免疫調節、兒茶酚胺代謝、GABA-A受體活性、細胞因子-細胞因子受體相互作用等有關。

5 結語

SCI是多因子、多因素、多生物過程共同作用的結果。本研究發現，川芎嗪可能通過炎癥反應、免疫應答、免疫調節、神經元離子通道聚集、細胞因子-細胞因子受體相互作用、神經活性配體-受體相互作用、氧化應激損傷、突觸重建、軸突感覺、髓鞘形成、神經性疼痛、GABA能突觸等生物學過程來發揮對SCI細胞凋亡、神經損傷的改善作用，可為后續研究提供新方向。但本研究也存在一定的局限性，如川芎嗪對SCI主要為輔助治療、未設置多個劑量組等，且上述結論尚未通過相關基礎研究予以驗證，故有待后續進一步研究證實。

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（收稿日期：2019-09-18 修回日期：2020-04-08）

（編輯：張元媛）