縫隙連接蛋白（Cx）在穩(wěn)定型冠心病中表達缺失的橫斷面研究

包麗雯 林楊毅 張津津 陳 華 施海明 李 劍 嚴萍萍△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院心內(nèi)科 上海 201901；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200040）

動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展由多種因素共同參與，其發(fā)病機制尚未完全闡明。縫隙連接蛋白（connexin，Cx）的表達異常與冠心病發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。Cx 是一組跨膜蛋白質(zhì)家族，Cx 組成了縫隙連接。縫隙連接是細胞連接的主要方式之一，發(fā)揮著加強細胞間機械聯(lián)系、維持組織結(jié)構(gòu)完整、協(xié)調(diào)細胞間功能活動的重要作用。分子物質(zhì)通過縫隙連接在細胞質(zhì)之間穿行、易化、擴散，因此Cx 的正常表達對細胞間的信息傳遞和相互作用有著重要影響［1-3］。在心血管系統(tǒng)中穩(wěn)定表達的Cx 有Cx37、Cx40、Cx43、Cx46 等，Cx37 主要表達于內(nèi)皮細胞和單核細胞中，Cx43 表達于內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、單核細胞中，Cx40和Cx46表達于內(nèi)皮細胞及其他白細胞［4-6］。

Cx 的表達改變會導(dǎo)致細胞間通訊功能紊亂，這或與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wong 等［7］發(fā)現(xiàn)，在載脂蛋白E 缺陷（ApoE-/-）的小鼠模型中，Cx37 缺失的小鼠與 Cx37 表達正常的小鼠相比，會發(fā)生更嚴重的冠狀動脈粥樣硬化。Jean 等［8］認為Cx 可能通過調(diào)控單核細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，影響一氧化氮的釋放，從而影響動脈粥樣硬化進程，Cx可能具有抗動脈粥樣硬化的作用。目前公認Cx37和Cx40 具有抗動脈粥樣硬化的屬性，而Cx43 對于動脈粥樣硬化的影響并不明確［9-10］。

本研究擬通過冠狀動脈內(nèi)取血來分離單核細胞，比較冠心病與非冠心病患者冠狀動脈系統(tǒng)內(nèi)皮-單核細胞中幾種Cx 的表達差異，以觀察Cx 對冠狀動脈粥樣硬化進程的影響。冠脈內(nèi)直接采血分離單核細胞，發(fā)現(xiàn)該單核細胞分泌的幾種在心血管中重要的縫隙連接蛋白的表達是本研究的創(chuàng)新之處。

資料和方法

研究對象本研究為單中心、小規(guī)模的橫斷面研究，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會批準（倫理號：KY2017-282）。于 2018 年 3—6 月，在因穩(wěn)定型心絞痛入復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院擬擇期行冠狀動脈造影（coronary aniography，CAG）的患者中，根據(jù)CAG 結(jié)論，將簽署知情同意書并同意經(jīng)冠狀動脈采血的患者分別歸入冠心病組及非冠心病組，同時進行冠狀動脈采血。

納入和排除標準納入標準：（1）年齡≥18 歲；（2）因穩(wěn)定型心絞痛入院，擇期行 CAG 的患者；（3）根據(jù)CAG 結(jié)論進行分組；冠心病（CAD）組為CAG明確至少有1 支冠狀動脈血管狹窄在70%以上，或行PCI 治療者；非冠心病（non-CAD）組為經(jīng) CAG 明確冠狀動脈僅存在散在斑塊或未見明顯異常者。

排除標準：（1）因急性心肌梗死入院接受治療的患者；（2）經(jīng)CAG 證實狹窄程度為輕中度（20%～50%）或狹窄程度中度以上（50%～70%）的患者；（3）拒絕進行冠狀動脈內(nèi)采血的患者。

病例收集及檢測指標收集入組患者的基線數(shù)據(jù)資料：年齡、性別、BMI 指數(shù)、吸煙史、血壓、血肌酐、尿酸、血脂水平、pro-BNP、左室射血分數(shù)、高血壓病史、糖尿病史等。

在行CAG 時，將患者冠狀動脈血樣（3 mL）收集于抗凝管中，立即用4 800 r/min 離心機（離心半徑24 cm）高速離心15 min 后，取上層血漿并分離單核細胞，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。待所有患者血標本收集完成后，采用單盲法，由實驗人員對分離得到的單核細胞標本的 Cx37、Cx40、Cx43、Cx46 進行qRT-PCR 定量分析。用TRIzol 從離心的單核細胞中 提 取 RNA，并 使 用 RT-master（RR036，日 本TAKARA 公司）將其逆轉(zhuǎn)錄成CDNA。用qRFPCR 方法檢測 Cx37，Cx40，Cx43，Cx46 mRNA 表達水平。TB Green RR420 作為參考基因。

統(tǒng)計學(xué)方法Stata 13.0 軟件對患者基線資料及分子標志物的定量結(jié)果進行分析。基線資料中呈正態(tài)分布的連續(xù)變量用兩組t檢驗（±s），非正態(tài)分布的兩組連續(xù)變量用秩和檢驗［Median（P25，P75）］，非連續(xù)變量用χ2檢驗（%）進行統(tǒng)計分析。采用Logistic 多因素回歸分析分別對Cx37、Cx40、Cx43、Cx46 進行組間統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計意義。

結(jié) 果

入組情況研究時間窗內(nèi)，共122 例患者行CAG，91 例患者簽署知情同意書。經(jīng)造影結(jié)果確認，最終81 例入選。其中35 人歸入冠心病組、46 人歸入非冠心病組，均完成病史采集、血樣采集及單核細胞分離工作（圖1）。

圖1 研究對象入組流程圖Fig 1 Group flow chart of the participants

基線資料比較兩組患者年齡、性別、BMI、血壓、腎功能、血脂代謝水平、左室射血分數(shù)、Pro-BNP、既往高血壓病病史、既往腦梗病史、既往外周血管病病史差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。但冠心病組患者糖尿病患病率（44.3%vs.19.8%，P=0.025）及糖化血紅蛋白水平（6.78%±1.35%vs.5.75%±0.27%，P=0.04）顯著高于非冠心病組患者（表1）。

Cx 表達結(jié)果對兩組患者單核細胞的縫隙連接蛋白qRT-PCR 定量分析結(jié)果提示：與非冠心病組相比，冠心病組患者的 Cx37、Cx40、Cx43、Cx46 表達均降低，其中Cx43 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

多因素分析Logistic 多因素回歸分析提示：在校正混雜因素后（年齡、性別、BMI、高血壓病、糖尿病、低密度脂蛋白、eGFR、高尿酸血癥、糖化血紅蛋白），冠心病組Cx43 的低表達有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=0.54，P=0.023，95%CI：0.47～0.95；OR=0.63，P=0.043，95%CI：0.41～0.98）（表3），ROC 曲線下面積為 0.86。CHD 組 Cx37、Cx40、Cx46 表達 低于 non-CHD 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

血管內(nèi)皮功能受損時，此受損區(qū)域開始表達黏附分子E-選凝素（E-selectin）、白細胞黏附受體（leukocyte adhesion receptor）等，隨后 LDL-C 開始向內(nèi)皮細胞聚集并氧化，氧化的LDL-C 連同黏附分子導(dǎo)致單核細胞等向內(nèi)皮細胞聚集、黏附，并遷移至內(nèi)膜下，發(fā)動動脈粥樣硬化。此時，單核細胞表面表達的唾液酸化路易斯寡糖與內(nèi)皮細胞表面的炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的E-選凝素等相互作用，介導(dǎo)單核細胞貼壁，并通過后續(xù)各因子的共同作用影響動脈粥樣硬化進程［11-12］。

表1 冠心病組與非冠心病組基線特征比較Tab 1 Baseline comparison between CAD group and non-CAD group （±s）

表1 冠心病組與非冠心病組基線特征比較Tab 1 Baseline comparison between CAD group and non-CAD group （±s）

BMI：Body mass index；SBP：Systolic blood pressure；DBP：Diastolic blood pressure；eGFR：Estimated glomerular filtration rate；UA：Uric acid；LDL-C：Low density lipoprotein cholesterol；HDL-C：High-density lipoprotein cholesterol；TG：Triglycerides；HAlbc：Glycated hemoglobin；LVEF：Left ventricular ejection fraction；T2DM：Type 2 diabetes mellites；PAD：Peripheral vascular disease.

P value 0.89 0.87 0.84 0.17 0.69 0.43 0.56 0.64 0.15 0.22 0.37 0.04 0.51 0.55 0.41 0.025 0.53 0.44 Characteristics Age（y）Male（%）BMI（kg/m2）Smoker（%）SBP（mmHg）DBP（mmHg）eGFR（mL·min-1·1.73 m-2）UA（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）TG（mmol/L）HAlbc（%）Nt-Pro-BNP（pg/mL）LVEF（%）Hypertension（%）T2DM（%）Stroke（%）PAD（%）CAD group（n=35）66.3±12.9 62.9 24.5±2.8 66.4 133.8±17.5 77.1±6.8 80.1±22.4 352.6±45.3 2.23±0.77 1.13±0.27 1.88±1.25 6.78±1.35 154.1±33.1 68.3±4.8 62.6 44.3 10.4 12.3 non-CAD group（n=46）65.7±7.3 59.4 23.4±3.7 52.5 130.9±10.9 79.9±8.7 86.0±22.5 332.5±47.8 2.78±0.83 1.31±0.35 1.41±1.02 5.75±0.27 107.7±27.8 69.9±4.7 52.3 19.8 18.2 21.7

表2 冠心病組與非冠心病組患者Cx 表達量差異比較Tab 2 Connexins comparison between CAD group and non-CAD group

表3 冠心病組與非冠心病組患者Cx 的Logistic多因素回歸分析Tab 3 Logistic regression of connexins in terms of CAD group compared with non-CAD group

單核細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附與相互作用極依賴于細胞連接結(jié)構(gòu)，縫隙連接是一種重要的細胞連接。單核細胞僅存在于血管中，單核細胞表面表達Cx，介導(dǎo)單核細胞與內(nèi)皮細胞之間的相互作用。當(dāng)Cx 基因缺失時，單核細胞與內(nèi)皮貼壁作用加速，加重動脈粥樣硬化。例如，在早期血管內(nèi)皮功能受損情況下，黏附分子會伴隨Cx37、Cx43 等表達異常而發(fā)生變化，引起脂質(zhì)殘片向內(nèi)膜下沉積及炎癥因子浸潤，為巨噬細胞游走并形成泡沫細胞形成粥樣硬化斑塊提供條件［13-15］。

我們通過橫斷面研究觀察Cx37、Cx40、Cx43 和Cx46 對冠狀動脈粥樣硬化的影響，發(fā)現(xiàn)冠心病組患者的 Cx37、Cx40、Cx43、Cx46 表達量均低于非冠心病組患者，其中Cx43 表達降低有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。提示與其他Cx 相比，Cx43 可能在冠心病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。通常，在單核細胞表面低表達Cx37 且不表達其他Cx，但隨著TNF-a 和IFN-r 等免疫因子的刺激，泡沫細胞開始高表達Cx37 和Cx43。T 細胞在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中有重要作用，CD4 抗原陽性的細胞（包括一些CD8+）可以介導(dǎo)斑塊形成的免疫反應(yīng)，形成局部炎癥，促進斑塊形成。當(dāng)樹突狀細胞的抗原呈遞細胞-Ⅱ分子與T 淋巴細胞受體橋接時，Cx43 聚集在免疫突觸附近的外側(cè)面。Cx43 表達增加可明顯減少T 細胞抗原識別后的細胞內(nèi)鈣振蕩，減少T 細胞分泌IFN-γ。因此，Cx43 對T 細胞的局部活化可能起重要的作用［17］。鄭濤等［17］通過分析認為在冠心病及心肌梗死患者中，Cx43 可能從改善線粒體功能開始，發(fā)揮改善心肌缺血再灌注損傷修復(fù)的作用。陳林等［18］觀察到在心肌梗死患者中，心肌不同部位Cx43表達差異較大，在部分梗死中心區(qū)表達甚至完全消失，并發(fā)生少量的重新分布；而在非梗死處心肌Cx43 表達量基本正常，但該處細胞閏盤的Cx43 亦稍被破壞，而重新分布于細胞一側(cè)相接處。心肌缺血時Cx43 會發(fā)生脫磷酸化，且程度與心室肌細胞電耦聯(lián)障礙程度呈正相關(guān)，缺血癥狀改善后，隨著該處Cx43 恢復(fù)磷酸化功能，心肌的收縮功能會逐漸恢復(fù)，但若該患者存在Cx43 的表達缺失，將影響心肌功能的恢復(fù)。我們的研究結(jié)論與部分文獻一致，但也有不盡相同之處。提示Cx43 表達在人群中存在基因多態(tài)性的問題，低表達Cx43 人群可能對動脈粥樣硬化易感。

綜上所述，冠心病患者中 Cx37、Cx40、Cx43、Cx46 表達量低于非冠心病患者，其中Cx43 表達降低，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。Cx43 缺失可能是影響冠心病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子。

本研究為觀察性研究，且樣本量較小，尚需在大規(guī)模人群中對基因多態(tài)性觀察并進行驗證。此外，僅為單中心的橫斷面研究，只觀察了我中心患者穩(wěn)定型冠心病與Cx 表達量的相關(guān)性，并不能明確因果關(guān)系，尚需多中心合作的大樣本量的前瞻性研究進行驗證。