隔姜灸天樞穴對UC大鼠結腸組織的miRNA表達譜的影響

顧沐恩，趙繼夢，吳煥淦，鄭寒丹，劉雅楠，程玲，馬喆，吳璐一，李璟，黃艷，楊玲

(1.上海市針灸經絡研究所，上海 200030;2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437;3.上海市東方醫院，上海 200120;4.上海中醫藥大學針灸免疫效應重點研究室，上海 200030)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病，近年來研究認為，遺傳、免疫、環境、腸道菌群等是其重要的發病機制[1-4]。隨著人們生活方式和飲食結構的改變，UC在中國的發病率有逐年升高的趨勢[5-6]，而UC患者因長期而廣泛的結腸潰瘍、炎癥引起的結腸癌變率達3.7%～5.7%[7]，尤其是8年以上的全結腸炎，結腸癌變風險開始逐漸增加[8]。因此，深入研究UC的發病機制，盡早干預UC，預防癌變的發生對臨床上UC的診斷和治療均有重要意義。

近10年來，微小RNA(microRNA，miRNA)在各種疾病中的作用被廣泛關注。大量的研究證實了miRNA的功能和潛在價值[9]。相關研究發現，miRNA可調節人類10%～30%的基因表達，在細胞增殖、分化、凋亡、新陳代謝和腫瘤中發揮重要的作用[10]。miRNA為基本的炎癥型信號通路的調節方式，可導致不同的炎癥性疾病[11]，包括炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)[12-13]。有研究發現，UC疾病中的一些在外周血與結腸組織中功能失調的miRNAs，能通過調節mRNA的表達水平抑制結腸的炎癥反應[12]，從而有潛力治療UC并預防癌前病變[14]。

本研究團隊多年研究發現，艾灸可有效改善UC患者的生活質量，減輕腸道炎癥反應[15-17]。隔姜灸作為艾灸的1種，因其操作簡便、效果顯著，亦被廣大患者所接受。但隔姜灸對UC的效應機制尚不完全明確，是否可以通過改變UC結腸miRNAs的表達，發揮抑制炎癥的作用?因此，本研究采用4% DSS誘導UC大鼠模型，隔姜灸 UC大鼠雙側天樞穴，應用高通量測序的方法，從miRNA的角度研究隔姜灸對UC大鼠結腸miRNA表達譜的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

30只健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體質量(180±20)g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供[購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證號SCXK(京)2012-0001]。飼養條件為清潔級，12 h晝夜節律交替(7—19點照明)，室內溫度(20±2)℃，室內濕度50%～70%，適應性飼養1周后開始正式實驗。實驗嚴格按照美國國立衛生研究院實驗動物的使用指南執行，實驗過程中對動物的處置遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》規定。將30只大鼠隨機分為正常組(NC組)、模型組(UC組)和隔姜灸組(GM組)，每組10只。

1.2 主要設備和試劑

NanoDrop-2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國);TapeStation 2200(Agilent Technologies Inc，美國);Illumina HiSeq 2000 測序儀(Illumina，美國);BioRad CFX96TM實時 PCR系統(Bio-Rad Laboratories，CA，USA);葡聚糖硫酸鈉(36-50 kDa，#160110，MP Biomedicals，美國);TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific，美國);Illumina TruSeq小 RNA樣品預處理試劑盒(Illumina，美國);Qubit 2.0 Fluorometer using the dsDNA HS and/or BR assay kit(Life Technologies，美國);TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina，CA，USA);RNase 抑制劑(ThermoFisher Scientific，USA)。

1.3 UC模型建立[18]

UC組和GM組大鼠予以4% DSS自由飲水7 d制備UC大鼠模型。造模后，每組取 2只采用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色觀察造模是否成功。造模成功后，UC組和GM組大鼠繼續予1% DSS自由飲水7 d以維持腸道炎癥。

1.4 艾灸干預

造模成功后，GM組大鼠同時予以隔姜灸干預。取雙側天樞穴。生姜沿纖維縱向切取，切剪成厚0.3 cm、直徑1 cm大小的姜片。將艾絨用模具制成直徑和高度均為0.6 cm、重約90 mg的艾炷。采用固定器固定大鼠后，暴露雙側天樞穴，提前1 d將天樞穴局部鼠毛剔除，將制成的艾炷放在姜片上，然后將姜片放置于穴位上，點燃艾絨，每次每穴灸2壯。每日1次，共干預7 d。此外，采用與GM組相同的方法對NC組和UC組大鼠進行固定。

1.5 樣本采集

隔姜灸干預 7 d后，用 2%戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)對各組大鼠進行腹腔注射麻醉，在距離肛門1 cm處采集長6～8 cm的遠端結腸。每個結腸分成兩部分，一部分用4%多聚甲醛固定用于HE染色;另一部分剪碎后置于凍存管中，用液氮凍存 1 h后保存在-80℃冰箱用于miRNA檢測。

1.6 HE染色

每組5只大鼠4%多聚甲醛固定的結腸組織脫水修片后，沿著結腸的腸系膜將結腸垂直石蠟包埋固定，將組織切成 4 μm厚，經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化，HE染色后脫水、透明、封片，玻片晾干后在低倍鏡和高倍鏡下觀察結腸組織病理形態學變化。

1.7 miRNA的cDNA文庫構建、RNA-seq高通量測序和數據分析

每組取 3只超低溫凍存的結腸組織采用 Trizol的方法提取總RNA，采用Nanodrop2000檢測其純度和濃度，采用安捷倫 2200檢測總 RNA的完整性，將 RIN值大于 8的總 RNA用于文庫構建。每個樣本取 3 μg總RNA建立miRNA文庫，根據Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits (Illumina，San Diego，CA)操作說明分別選取不同的index標簽建庫。建庫完成后，利用安捷倫 2200檢測文庫的質量。本實驗采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)試劑在cBot上生成簇，接著在Hiseq2000測序平臺上運行單端測序程序。測序過程由 Illumian提供的 Data collectionsoftware進行控制，實時數據分析。與參考序列比對，采用 DESeq進行分析，計算變化倍數(fold change，FC)和P值，設定 FC≥1.5為上調，FC≤0.5為下調，P＜0.05為差異有統計學意義。

1.8 miRNA靶基因預測及其Pathway通路分析和GO分析

對miRNA進行靶基因預測，使用MIRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)，miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)與TargetScan6.2(http://www.targetscan.org/vert_60/)進行聯合分析。最后對3個軟件的預測結果取其交集。分析靶基因顯著富集的 Pathway信號通路，同時進行基因本體(gene ontology，GO)富集分析，P＜0.05 為顯著富集。

1.9 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件分析，對數據資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，若服從正態分布且方差齊時組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差法(least significant difference，LSD)進行檢驗，方差不齊時用Dunnett’s T3法;若資料不服從正態分布，組間比較采用非參數檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi法進行。統計檢驗水準均為α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隔姜灸改善UC大鼠結腸組織病理學損傷

NC組大鼠結腸組織黏膜上皮完整，表面無潰瘍，各層組織結構清晰，腺體排列整齊，黏膜、黏膜下層未見充血水腫，無炎性細胞浸潤;UC組的大鼠結腸組織黏膜上皮缺失，有較大潰瘍面，黏膜層腺體減少，部分腺體形態異常，排列不整齊，有大量的淋巴細胞、漿細胞和中性粒細胞等炎性細胞浸潤，充血、水腫明顯;與UC組比較，GM組黏膜上皮較完整，少量腺體形態異常，排列欠整齊，黏膜下層可見少量的炎性細胞，未見明顯的充血、水腫。詳見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學觀察(HE染色，×200)

2.2 DSS誘導的UC結腸組織的差異表達miRNAs

通過測序分析，設定各組間 FC≥1.5為上調miRNAs，FC≤0.5為下調 miRNAs，以P＜0.05為差異有統計學意義。差異表達miRNAs的熱圖分析可直觀地觀察每個樣本之間的均一性和每組之間的表達差異，熱圖中可見各組兩個樣本的表達較為一致，兩組之間有明顯的差異。與NC組比較，UC組大鼠結腸組織差異表達miRNAs有45個，其中上調的有42個，下調的有3個，其中miRNA表達變化的差異倍數＞3的有4個，即miR-490-5p (FC=3.09)、miR-204-3p(FC=3.04)、miR-3585-3p(FC=14.72)、miR-378b(FC=5.88)。其中miR-3585-3p上調了14.72倍，是上調最大的miRNA。詳見圖2。

2.3 隔姜灸天樞穴改變UC大鼠的結腸組織中部分差異表達的miRNAs

熱圖中可見各組 3個樣本的表達較為一致，兩組之間有明顯的差異。與UC組比較，GM組的結腸組織差異表達miRNAs有8個，其中上調3個，下調5個。隔姜灸改變了UC大鼠結腸組織部分miRNAs的異常表達，其中下調的 miRNAs有 3個，即 miR-128-3p、miR-139-5p、miR-204-3p;上調的有5個，即miR-324-5p、miR-20a-5p、miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-184。詳見圖3。

圖2 NC組與UC組結腸組織miRNA表達的熱圖

圖3 GM組與NC組結腸組織miRNA表達的熱圖

圖2和圖3中有3個共同差異表達的miRNAs，即miR-184、miR-139-5p和 miR-204-3p。其中miR-184在UC模型中下調，隔姜灸干預后上調;miR-139-5p和miR-204-3p在UC模型中上調，隔姜灸干預后下調。詳見表1、表2。

表1 UC組與NC組結腸組織miRNA表達

表2 GM組與UC組結腸組織miRNA表達

2.4 隔姜灸逆轉UC結腸組織miRNAs靶基因的GO分析

對miR-184、miR-139-5p和miR-204-3p的預測靶基因進行 GO分析的結果顯示，參與分子功能(molecular function)的基因有115個，主要涉及蛋白域的特異結合(protein domain specific binding)、磷酸酯水解酶活性(phosphoric ester hydrolase activity)和磷酸酶活性(phosphatase activity)等;參與細胞組成(Cellular Component)的基因有234個，主要涉及細胞骨架部分(cytoskeletal part)，細胞投射部分(cell projection part)，樹突(dendrite)等;參與生物過程(Biological Process)的基因有453個，主要涉及有機物質運輸(organic substance transport)、神經系統發育(nervous system development)、神經元分化(neuron differentiation)和細胞投射組織(cell projection organization)等。詳見圖4。

2.5 隔姜灸逆轉 UC結腸組織 miRNAs相關靶基因Pathway分析

對miR-184、miR-139-5p和 miR-204-3p的預測靶基因進行KEGG顯著富集通路分析的結果顯示，主要涉及的通路有25個，主要分為4大類，分別為細胞過程(cellular processes)、環境信息處理(environmental information processing)、人類疾病(human diseases)和有機體系統(organismal systems)。涉及的主要通路有cAMP信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的microRNA、cGMP-PKG信號通路、AMPK信號通路、心肌細胞腎上腺素能信號轉導等。詳見圖5。

圖4 miRNAs相關靶基因的GO分析

圖5 miRNAs相關靶基因的Pathway分析

3 討論

潰瘍性結腸炎是一種病因尚不十分明確、以結直腸黏膜連續性、彌漫性炎癥改變為特點的慢性非特異性腸道炎癥性疾病[19]。臨床以持續或反復發作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急后重為主要表現[20]。UC可發生于任何年齡，青壯年期多見[21]，給患者帶來了巨大的精神壓力和沉重的經濟負擔。艾灸作為中醫學傳統療法，已被越來越多的患者接受和認可。本課題組多年來研究灸法(溫和灸、隔藥餅灸和隔姜灸)對炎癥性腸病的作用，發現隔藥餅灸能改善UC患者腹痛、腹瀉及便血的癥狀，對UC患者療效確切[15-16，22]。動物實驗研究顯示，隔藥餅灸天樞穴能調節UC大鼠炎癥細胞因子、腸道菌群和腸黏膜免疫，抑制腸上皮細胞凋亡，達到修復UC結腸黏膜損傷和減輕炎癥反應的作用[23-25]。本課題組也對隔藥餅灸和隔姜灸的療效進行了比較，發現隔藥餅灸和隔姜灸天樞穴均是治療慢性UC的有效方法，兩者總體療效相當[22]，這兩種灸法都可以通過調節黏蛋白的表達，起到修復UC大鼠結腸損傷的作用[26]。本研究也發現隔姜灸可以減輕UC大鼠的結腸炎癥。但是，目前隔姜灸治療UC的作用機制研究仍相對較少。

隨著基因芯片和高通量測序的發展，miRNA在 UC發生發展中的作用逐漸被揭示，UC疾病相關的miRNAs可調節炎癥細胞的趨化、轉錄因子的活性、腸上皮屏障功能和細胞自噬的活性[27-29]。因此，本課題組從miRNA的角度觀察DSS誘導的UC大鼠結腸組織miRNA表達譜的變化及隔姜灸的調節作用，探討隔姜灸治療UC的作用機制。結果發現，在DSS誘導的UC大鼠結腸組織中表達改變的miRNAs有45個，其中上調42個，下調 3個。其中的 miR-126、miR-140、miR-214、miR-340、miR-532被早期研究發現在UC及其相關性癌變中有改變，2008年Wu F等[12]首次發現miR-126在活動期 UC結腸組織中表達上調，進一步研究發現miR-126可以通過下調NF-κB信號通路的重要抑制因子IκB的表達促進UC的炎癥反應[30];miR-140能作用于其靶基因 HDAC4而克服抗結腸癌藥物的耐藥性[31]，其在結直腸癌組織中表達上調，并能通過靶向抑制TRAF6的表達減少LPS介導的人結直腸癌細胞的炎性細胞因子TNF-α、IL-6、COX-2的表達[32];miR-214被發現在 UC和結腸炎相關性癌變的結腸組織中表達均明顯上調，可通過調節轉錄因子NF-κB、STAT3的表達促進 IL-6的分泌，激活炎癥反應[33];miR-340則在 UC患者外周血血清中表達升高[34];miR-532也與UC免疫炎癥反應相關，在活動性和非活動性的UC患者的外周血中表達均上調[35]。因此，上述5個miRNAs可能通過其特定的靶基因，影響炎癥因子的表達，從而參與了UC的病理過程，但具體的作用機制以及其余差異表達的miRNAs是否在UC中發揮作用還需進一步的研究。

艾灸可以抑制 UC結腸炎癥，發揮免疫調節的作用[36-37]。本課題組前期研究了隔藥灸天樞穴對UC大鼠結腸組織miRNA表達譜的影響，發現隔藥灸能上調UC中異常表達的miR-184，下調異常表達的miR-490-5p[18]。而在本研究中，隔姜灸能上調UC大鼠結腸中異常表達的 miR-184，下調異常表達的miR-139-5p和miR-204-3p，可見隔藥灸和隔姜灸對UC大鼠結腸miRNAs的調控具有共性和特性，這可能與隔物灸所用的間隔物不同有關。課題組重點關注了隔姜灸可調控的3個 miRNAs。已有研究發現 miR-139-5p的缺失可以使小鼠對DSS誘導的結腸炎具有更高的敏感性，并增強腸道腫瘤的形成[38]，miR-139-5p還可以通過抑制NF-κB的活性，調節慢性炎癥，抑制結直腸癌細胞的增殖和入侵[39]。miR-204-3p在結腸癌細胞中表達減少，它可以通過靶向 HMGA2抑制結腸癌細胞的生長、遷移和侵襲[40]。以上說明miR-139-5p和miR-204-3p具有抑制結腸炎相關性癌的作用，但它們在UC中的作用尚未見有報道。結合本研究的結果，課題組猜測miR-139-5p和miR-204-3p在結腸炎和結腸炎相關性結腸癌中的表達和作用可能是不同的。由于UC具有較高的發展為結直腸癌的風險[41]，慢性炎癥在向腫瘤的發展過程中涉及的機制十分復雜，可能會導致相關分子和物質表達的改變。在炎癥過程中，LPS誘導的巨噬細胞中 miR-184的表達也降低[42]，這與本研究中UC炎癥條件下miR-184的表達降低是一致的。因此miR-139-5p、miR-204-3p和miR-184可能與UC的發展及艾灸的治療作用密切相關，但這幾個miRNAs在UC中的表達情況以及是如何發揮作用的還有待深入研究。

此外，通過對miR-184、miR-139-5p和miR-204-3p的預測靶基因的GO分析和KEGG富集通路分析，發現涉及的主要通路有cAMP信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的microRNA、Cgmp-PKG信號通路、AMPK信號通路、心肌細胞腎上腺素能信號轉導等。綜上所述，隔姜灸可能通過調節 UC結腸組織中 miR-139-5p、miR-204-3p和miR-184的異常表達，影響其靶基因的轉錄，繼而調控下游的相關炎癥信號通路，減少免疫炎癥因子的分泌和釋放，起到減輕DSS誘導的UC大鼠腸道炎癥的作用。后續將從表觀遺傳修飾—非編碼 RNA介導的基因沉默的角度，結合臨床研究、動物實驗和體外實驗來驗證差異表達的 miRNAs，找出其直接調控的靶基因，并明確這些靶基因的功能和作用，這將有助于深入探討隔姜灸對UC的免疫調節機制。