電針干預對放射線照射小鼠海馬區突觸蛋白-1表達的影響

武鑫，孫寧寧，王冬慧，張松江，高劍峰

(1.河南中醫藥大學基礎醫學院，鄭州 450046;2.河南中醫藥大學研究生院，鄭州 450046)

前期實驗研究表明采用 X射線照射實驗小鼠后，可造成小鼠新物體認知能力的損傷，表現為在曠場實驗中放射線照射小鼠垂直及水平運動時間、修飾次數較對照組小鼠均顯著減少，而在新物體認知實驗中放射線照射小鼠在兩個檢測時間點對新物體探索時間及認知指數均明顯下降[1]。不同療程電針干預可抑制海馬區神經元的凋亡，一定程度逆轉上述由放射線照射所導致的認知功能損傷[2]。已有研究表明在中樞神經系統中海馬區是對放射線照射最敏感的核團，X射線照射可產生大量的自由基，嚴重損傷該區域神經元的形態功能以及突觸傳遞功能，最終引起腦組織退行性病變[3-4]。在中樞神經系統，神經元通過形成功能性的突觸相互聯系，構成神經回路發揮功能。突觸可塑性是指突觸在數量、形態和功能上有序地發生變化，是大腦學習記憶功能的分子生物學基礎[5]。因此，本實驗在前期實驗結果基礎之上，探討電針干預對放射線照射小鼠海馬區依賴性空間學習記憶功能以及突觸結構功能的作用及影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

40只健康清潔級C57BL/6J小鼠，雄性，1月齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物合格證號11400700063049)。將小鼠置于 7:00—19:00光照和19:00—7:00黑暗的實驗室，食水不限。按隨機數字表法將小鼠分為對照組10只、放射線照射組(8 Gy)10只、電針穴位組10只、電針非穴位組10只。

1.2 主要儀器與試劑

全自動Morris Water Maze(淮北正華生物儀器設備有限公司);直線加速器(Varian Clinac 600 CD，Radiation Oncology Systems，SanDiego，CA，USA);電針儀(上海華誼醫用儀器有限公司，G6805-2A);石蠟切片機(Leica，型號 2235);體視學顯微鏡(Leica，型號 M205FA);投射顯微鏡(日立，型號 H-7500);圖像分析系統Image-Proplus5.1(Media Cybemetics Inc.USA，型號 41N5100-44800);低溫高速離心機(日立，CF6RXⅡ);核酸定量儀(島津，Biospec-nano);生物分子成像儀(富士，LAS-4000MINI);凝膠成像儀(Bio-Rad);syanpsin 1抗體(Abcam，ab64581);β-actin抗體(Abcam);HRP標記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，ZB-2301)，PageRμl er? Prestained Protein Ladder(Fermentas，SM0671)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司，300000-B)，eECL Western Blot Kit高靈敏度化學發光檢測試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司，CW0049)。

1.3 實驗方法

1.3.1 X射線照射方法[1]

雄性 C57BL/6J小鼠腹腔注射 2%戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g)麻醉，將動物俯臥位固定于放射平臺，左側大腦半球照射范圍 1 cm×2 cm，射線源距離腦99.5 cm，照射劑量為8 Gy，劑量率為400 cGy/min，照射過程約持續10 min，采用PRIMUS型高能醫用電子直線加速器X射線進行照射。用鉛模覆蓋避免呼吸肌消化道系統損傷，照射完成后將動物送回鼠籠，電針穴位組和電針非穴位組第2天開始給予電針干預。

1.3.2 電針干預

電針方法參考發表文獻[6]，電針穴位組取百會(頂骨正中)、風府(枕骨頂嵴后枕寰關節背凹陷處，雙側腎俞(第2腰椎后兩旁凹陷處)，用無菌針灸針(蘇州醫療用品廠，0.30 mm×13 mm)向后斜刺入，深度約1 mm，連接電針儀，百會、風府接1組，雙側腎俞接1組，參考文獻[7]設置刺激參數，電壓1.5 V，頻率10 Hz，波寬1 ms，電針時間每次30 min，每日1次，連續電針干預3周。電針非穴位組取尾根前 0.5 cm，后背正中線旁開0.3 cm;尾根前1.0 cm，后背正中線旁開0.3 cm，電針方法和療程同電針穴位組。

1.3.3 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗參考發表文獻[8]。水迷宮儀器為一直徑160 cm、高50 cm的圓形水池，內壁為黑色，池內水深30 cm，水溫為(22±2)℃，實驗室內光線恒定，水池周圍為豎起的不透光圍簾，保證無光線直射入水池內。水池壁上的4個等距離點將水池分為4個象限，并將第 3象限設為靶象限，在第 3象限距離池壁約40 cm處放置一直徑為 10 cm的透明平臺，高 28 cm，位于水面下2 cm處。水迷宮上方安置有攝像機，與電腦主機相連，同步記錄各組小鼠運行軌跡。定位航行實驗將各組小鼠連續訓練5 d，每日1次。具體訓練方法為將各組受試小鼠按順時針方向依次由 E、S、W、N入水點放入水中，并記錄小鼠在2 min內從尋找到水下平臺所需的時間(即潛伏期)。如果小鼠在2 min內未找到平臺，則由實驗人員將其引至平臺上并停留10 s，然后將其送回鼠籠中。在定位航行實驗結束后，進行空間探索實驗，將目的象限的平臺撤去，從同一入水點將各組小鼠放入水中，并記錄其在2 min內在原平臺所在象限停留時間以及穿越原平臺所在象限次數。

1.3.4 透射電鏡檢測突觸超微結構

取固定的海馬組織樣品PBS漂洗4次，每次10 min，然后進行1%鋨酸后固定1.5 h，PBS漂洗，脫水處理按30%→50%→70%(過夜)→90%→100%Ⅰ丙酮濃度脫水，再次浸入100%Ⅱ、Ⅲ丙酮各45 min，然后環氧樹脂812添加 4 h后聚合包埋，反應條件為 37℃ 12 h→45℃12 h→60℃ 24～48 h。待包埋組織完全聚合完畢后進行修整切片，切片厚度為 70 nm。超薄切片進行染色，染色方法為檸檬酸鉛5 min→醋酸雙氧鈾25 min。透射電鏡觀察并進行拍照，每組選取3只小鼠，每只小鼠選取 5個海馬切片觀察海馬區突觸數量及結構，統計突觸間隙及突觸后致密物厚度。

1.3.5 突觸蛋白-1 mRNA表達檢測

突觸蛋白-1基因表達RT-qPCR檢測，取各組小鼠海馬區新鮮組織置于液氮3 h，然后移入﹣80℃冰箱備用。利用RNA提取試劑盒提取總RNA，用紫外線分光光度計測定260 nm/286 nm吸光度比值及瓊脂糖電泳鑒定其純度。RT-qPCR方法，采用Prime Premier 5.0設計 引 物 ，synapsin-1(正 義 鏈 為5’-ATCCTCTCCTGGAGCTCTGA-3’， 反 義 鏈 為5’-GGGCTTCTTATGGAATTGGA-3’，95℃ 預 變 性1 min，95℃變性 15 s，60℃退火 1 min)。內參基因β-actin(正義鏈為 5’CAGGCATTGCTGACAGGATG-3’，反義鏈為3’-TGCTGATCCACATCTGCTGG-5’)。PCR產物用含 0.5 μg/mL溴乙啶的 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，LAS1000 CCD曝光系統進行檢測。突觸蛋白-1表達Western blot檢測取﹣80℃保存的小鼠海馬區腦組織(約 50 mg)放入預冷號的研缽中加入液氮研磨成粉末狀。

1.3.6 突觸蛋白-1蛋白表達檢測

常規組織蛋白質提取，將標本加入等量 3×SDSPAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)緩沖液，96℃加熱 5 min，樣本采用4%～20%的Tris-Glycine膠電泳90 min分離蛋白，然后轉移至硝基纖維膜。硝基纖維膜采用含5%脫脂牛奶的 TBST-T(30 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，100 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20)室溫振蕩封閉1 h，然后用 1×TBST-T反復洗滌后與 synapsin-1一抗(1:500稀釋)室溫4℃過夜孵育。取出膜用TBST4次，每次 5 min，漂洗過后與過氧化物酶標記的二抗(1:1000稀釋)室溫振蕩孵育1 h，TBST洗滌后在顯色底物液(Pierce，Rockford，IL)中顯色 5 min，采用 LAS1000 CCD曝光系統檢測特異性條帶，并以β-actin為內參蛋白對樣品條帶進行半定量。

1.4 統計學方法

實驗數據采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析。符合正態分布的數據均以均數±標準差表示。水迷宮實驗結果采用重復測量方差分析結合Tukey’s multiple comparisons test檢驗，分子生物學實驗結果采用單因素方差分析結合Tukey’s multiple comparisons test檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針干預對放射線照射小鼠空間學習記憶功能的影響

水迷宮實驗表明，與對照組比較，放射線照射組小鼠潛伏期呈現顯著增加的趨勢，其中在第 2天至第 5天兩組差異具有統計學意義(第2天P＜0.05，第3天P＜0.05，第4天P＜0.01，第5天P＜0.01)。而與放射線照射組比較，電針穴位組則在第3天(P＜0.01)、第4天(P＜0.01)以及第5天(P＜0.01)尋找平臺潛伏期顯著縮短。此外，放射線照射組與電針非穴位組之間沒有明顯差異(P＞0.05)。空間探索實驗結果表明放射線照射組小鼠在穿越平臺所在目的象限次數以及在目的象限停留時間均較對照組顯著降低(P＜0.01)。而電針穴位干預后小鼠的上述兩項指標均顯著增加，并且與放射線照射組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，電針非穴位組則沒有上述影響。結果見圖1。

圖1 電針干預對小鼠尋找平臺潛伏期及空間探索能力的影響

2.2 電針干預對放射線照射小鼠海馬區突觸結構的影響

行為學實驗表明電針干預可一定程度改善放射線照射所致的學習記憶能力的損傷，而海馬區突觸功能是學習記憶的分子學結構基礎，因此檢測了各組小鼠海馬區突觸結構的改變。在同一倍數下觀察各組小鼠海馬區可見，對照組突觸數量最多，結構明確且完整，突觸間隙清晰。而放射線照射組突觸間隙不清晰，結構不完整，電針穴位組較放射線照射組有所改善，突觸結構明確，間隙較為清晰。實驗結果表明與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區突觸間隙及突觸后致密區厚度均發生了明顯變化，如圖中矩形標示突觸間隙顯著減小(P＜0.05)，如圖中箭頭標示突觸后致密區厚度也顯著減小(P＜0.01)。而與放射線照射組比較，電針穴位組小鼠海馬區突觸間隙增加(P＜0.05)，突觸后致密區厚度也顯著增加(P＜0.05)。電針非穴位組不具有上述影響作用，變化不明顯。結果見圖2。

圖2 電針干預對小鼠海馬區突觸結構的影響

2.3 電針干預對放射線照射小鼠海馬區突觸蛋白-1表達的影響

進一步從基因與功能蛋白表達兩個水平檢測了海馬區與突觸傳遞效應密切相關的功能蛋白突觸蛋白-1的表達變化。實驗結果表明，與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區突觸蛋白-1基因表達顯著下降(P＜0.05)，而電針干預后該基因表達則顯著升高(P＜0.01)。實驗結果還顯示海馬區突觸蛋白-1蛋白表達趨勢與基因表達實驗結果一致。與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區突觸蛋白-1蛋白表達水平均顯著下降(P＜0.01)，而電針穴位干預后小鼠海馬區突觸蛋白-1蛋白表達水平較放射線照射組顯著增加(P＜0.05)，電針非穴位組則沒有上述變化。結果見圖3。

圖3 電針干預對小鼠海馬區突觸蛋白-1表達的影響

4 討論

學習記憶是大腦的高級功能之一，所涉及的腦區復雜，并且與不同腦區的蛋白分子變化密切相關。其中海馬區是公認的與學習記憶過程密切相關的功能腦區[9-11]。海馬區突觸結構及功能的損傷會影響新事物學習及記憶過程[12]。前期實驗結果發現放射線照射可顯著損傷小鼠新物體認知功能，給予電針穴位干預則一定程度改善了上述損傷作用。Morris水迷宮是廣泛應用于學習記憶功能評價的經典行為學實驗方法[13-14]，可以較為客觀地評價實驗對象的空間學習和記憶能力[15-16]。本實驗結果顯示在水迷宮實驗中放射線照射組小鼠尋找平臺潛伏期顯著增加，穿越平臺所在目的象限次數和在目的象限停留時間顯著減少，而給予電針穴位干預可使小鼠尋找平臺潛伏期顯著縮短，穿越平臺所在目的象限次數增加，在目的象限停留時間延長。電針非穴位組則沒有上述影響。上述行為學結果說明電針穴位有效地促進了放射線照射小鼠空間學習記憶功能。

在中樞神經系統中，神經元之間通過形成功能結構——突觸相互聯系構成神經回路。到目前為止，大量研究認為學習記憶的獲得、儲存與再提取需要突觸在數量結構以及功能上發生改變，這種有序的變化被稱為突觸可塑性[17-18]。突觸可塑性被公認為是學習記憶功能的神經生物學基礎[19]。而臨床上一些與認知功能、學習記憶功能損傷相關的神經系統疾病均與突觸病理性改變密切相關[20-21]。邊緣系統是調節學習記憶功能的核心腦區[海馬區作為邊緣系統的重要組成部分，位于顳葉內腹側]，由海馬和齒狀回兩部分組成，被公認為與空間學習記憶功能密切相關[22]。海馬區突觸功能損傷會影響整體行為學的改變，研究報道海馬損傷后小鼠短期記憶丟失并且無法形成新的記憶[23]。突觸蛋白-1 (synapsin-1)是一種與突觸結構功能密切相關的功能蛋白質，參與調節突觸囊泡的移動，突觸前膜神經遞質的釋放等。有研究表明早期給予麻醉劑可減少突觸蛋白-1的表達，干擾突觸結構發育并導致認知功能損傷[24]。因此，突觸蛋白-1通過調控突觸前傳遞的效應在突觸可塑性中發揮了重要的作用。有研究表明電針具有促進神經遞質釋放，改善突觸超微結構，調節突觸可塑性等功能[25]。突觸后致密物質(postsynaptic density，PSD)是指突觸后膜內側一層分布均勻的致密物質，其中包括有可與突觸前釋放的神經遞質結合的受體、蛋白信號分子以及細胞骨架蛋白等[26]。有研究表明PSD蛋白可通過調節突觸后谷氨酸受體的動力學變化在突觸功能以及可塑性過程中發揮生理及病理學作用[27]。本實驗水迷宮實驗明確電針穴位改善了放射線照射小鼠空間學習記憶功能，進一步實驗發現放射線照射組小鼠海馬區突觸結構和間隙均出現明顯損傷，突觸間隙減小，PSD厚度下降，而電針穴位組小鼠海馬區突觸結構較明確，突觸間隙清晰，突觸間隙以及PSD厚度較放射線照射組均顯著增加。此外，分子生物學實驗結果顯示放射線照射組小鼠海馬區突觸蛋白-1基因及蛋白表達均較對照組顯著下降，而給予電針穴位干預則顯著提高了突觸蛋白-1的表達。上述實驗結果說明電針穴位可通過上調海馬區突觸蛋白-1的表達改善放射線照射小鼠突觸結構以及功能，增強突觸的可塑性，從而在整體水平增強了小鼠的空間學習記憶功能。

本研究利用整體行為學以及分子生物學方法探討了電針穴位對放射線照射所導致的學習記憶功能損傷的影響，并進一步檢測了與學習記憶密切相關的海馬區突觸結構及關鍵突觸蛋白的作用，結果表明電針穴位改善了放射線照射小鼠空間學習記憶行為損傷，這一影響作用與突觸結構改變以及突觸蛋白-1表達水平上調密切相關，說明電針穴位的改善作用機制與突觸可塑性有關，具體蛋白信號通路需進一步實驗探明。