木犀草素通過MIEF1抗H9c2心肌細胞損傷的機制研究

史有陽，楊 瑞，張 洋，孫霃平，劉 勝

上海中醫藥大學附屬龍華醫院中西醫結合乳腺科，上海200032

阿霉素(doxorubicin，Dox)為乳腺癌常用的化療藥物，是目前治療乳腺癌的一線藥物，也是術后輔助治療和姑息治療中重要的組成部分[1]。心臟毒性是阿霉素臨床應用主要不良反應之一，隨著劑量的增加，心臟毒性的發生率升高[2]，因此尋找減輕阿霉素心臟毒性的有效藥物具有重要意義。

中藥桔梗辛、苦、平，具有宣肺祛痰、利咽排膿的功效。神農本草經有云：“主胸脅痛如刀刺，腹滿腸鳴幽幽，驚恐悸氣”[3]。課題組前期研究發現，桔梗能夠提高阿霉素化療后乳腺癌病人的左心室射血分數，減輕阿霉素帶來的心臟毒副反應[4]。桔梗與阿霉素聯合應用可提升乳腺癌肺轉移小鼠左心室射血分數水平，增強心臟泵血功能，促進阿霉素在肺部的聚集，降低其在心臟的分布[5]。但具體藥物活性成分及作用機制并不明確。木犀草素(luteolin，Lut)是一種分布廣泛的類黃酮，常以糖苷類形式大量存在于包括桔梗在內的多種中藥中[6]。現代藥理學研究表明，Lut具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、心血管保護的功能[9]，但對心肌細胞保護的具體機制并不明確。本研究擬用阿霉素建立心肌細胞損傷模型，通過轉錄組學測序篩選出Lut作用靶點，并運用分子生物學技術，對潛在靶點線粒體延長因子1(mitochondrial elongation factor 1，MIEF1)進行抑制，探究Lut對人心肌細胞損傷的保護作用及機制，為進一步治療阿霉素化療后心臟毒性提供依據。

1 材料

1.1 細胞

野生型大鼠H9c2心肌細胞購自中國科學院上海細胞庫。低表達MIEF1大鼠H9c2心肌細胞由本實驗室構建。

1.2 藥物及試劑

木犀草素(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17102605，純度≥98%)；MTT粉劑(美國Sigma公司)；阿霉素(碧云天生物技術有限公司，批號：SC0159)；RPMI-1640 培養基(美國Hyclone公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶(美國Gibico公司)；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒(Life Q10212)；MIEF1抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-12634R)；p-Drp1(Ser637)，Caspase-3抗體(美國Cell Signaling公司，批號分別為4867，9662)；Trizol，GAPDH，HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(上海生工生物有限公司，批號B511311、D110016、D110058)；siRNA轉染試劑盒(蘇州吉瑪生物有限公司，批號G04003)。

1.3 儀器

細胞培養箱(美國Thermo公司)；Qubit2.0熒光計Q32866 Invitrogen；RT-PCR儀(美國 Thermo公司)；電泳儀及酶標儀(美國BIO-RAD公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)；HiseqTM測序儀(美國Illumina公司)。

2 方法

2.1 細胞培養

大鼠H9c2心肌細胞接種于含10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液的1640完全培養基，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養，每3天以0.25%胰酶消化傳代。

2.2 增殖抑制率測定

取5×103對數生長期H9c2細胞接種于96孔板中，置于培養箱中繼續培養。24 h后，棄去培養基，每孔加入Dox(1 μM)及不同濃度的Lut(5、10、20 μM)作用24 h。每孔加入15 μL MTT 反應4 h，加入DMSO 150 μL，振蕩5 min，用酶標儀測定波長為490 nm處的光密度值(OD值)，按下式計算：

細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組

OD值)/對照組OD值×100%

2.3 總RNA提取與測序

取對數生長期5×104個H9c2心肌細胞，種入6孔板。設置為正常組、Dox(1 μM)組、Dox(1 μM)加Lut(20 μM)組，每組3個樣本重復，藥物處理24 h后，加入氯仿，離心，異丙醇萃取后乙醇洗滌沉淀。干燥后，加入ddH2O溶解RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以短片段RNA為模板，合成一鏈cDNA，加入緩沖液、dNTP、RNase和DNA polymeraseⅠ合成二鏈cDNA；將雙鏈cDNA修復、加A尾并連接測序接頭，PCR擴增，按照1∶1的比例等量混合后，采用HiseqTM測序儀進行測序，Trimmomatic，HISAT2及StringTie 軟件分析測序數據[10]。

2.4 差異表達基因靶點篩選

采用DESeq進行顯著差異的基因分析，用Fold Change值表示基因表達的差異倍數，按|log2(Fold Change)|>1且P<0.05，q<0.05的原則篩選差異表達靶點基因(differentially expressed gene，DEG)。

2.5 低表達MIEF1基因H9c2細胞的構建及驗證

為了進一步明確MIEF1與Lut改善心肌細胞損傷的關系，利用分子生物學技術構建siRNA-MIEF1抑制H9c2細胞中MIEF1的表達。取對數生長期野生型大鼠H9c2心肌細胞，以5×104每孔種于6孔板內，待細胞貼壁后分為5組，正常組加入常規培養基，其余4組分別加入空載體siRNA、siRNA-MIEF1 1號、2號、3號Mate轉染試劑復合物，輕輕搖晃培養基均勻后放置37℃，CO2培養箱內轉染24 h，Western blot驗證MIEF1蛋白的抑制效果。

2.6 RT-PCR法驗證細胞MIEF1 mRNA表達情況

取對數生長期野生型大鼠H9c2心肌細胞，以5×104每孔種于6孔板內，分組及處理同“2.5”項，提取總RNA。MIEF1及GAPDH基因引物由蘇州吉瑪生物有限公司設計。MIEF1基因上游引物F5′-GGGAGGAACCAAACUGGAUTT-3′，下游引物R5′-AUCCAGUUUGGUUCCUCCCTT-3′，GAPDH基因上游引物F5′- GGTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3′，下游引物R5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。兩步法進行擴增，45個循環。

2.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測蛋白表達水平

取對數生長期H9c2心肌細胞，以每孔5×104個接種于6孔板，每孔2 mL，設置為正常組，低表達MIEF1加Dox(1 μM)組，Dox(1 μM)組，低表達MIEF1加Dox(1 μM)加Lut(20 μM)組。收集細胞，冰上裂解細胞30 min后，15 000轉離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，電泳、轉膜后，5%BSA封閉2 h。一抗根據說明書按1∶1 000稀釋，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，4°C孵育過夜。二抗根據說明書1∶2 000稀釋，加入二抗室溫孵育2 h后ECL化學發光顯色劑顯色，用凝膠分析系統掃描出圖像。

2.8 統計方法

3 結果

3.1 Lut對Dox誘導后H9c2 細胞活力的影響

與正常組比較，Dox組H9c2細胞活力顯著降低(P<0.05)；與Dox組比較，不用濃度Lut處理后，H9c2細胞活力明顯提升，細胞的存活率較Dox組有顯著差異(P<0.05)。20 μM Lut效果最好，因此后續選擇20 μM進行轉錄組測序(見表1)。

組別Group濃度Concentration(μM)存活率Survival rate(%)正常 Normal-100.00Dox160.00±3.69*Dox+Lut1+564.46±6.16#1+1083.60±2.90#1+2087.77±6.09#

注：與正常組比較，*P<0.05；與阿霉素組比，#P<0.05。

Note:Compared with normal,*P<0.05;Compared with Dox,#P<0.05.

3.2 細胞差異基因表達情況

將H9c2細胞轉錄組測序獲得的基因表達量進行標準化處理，兩組分別進行比較，篩選出P<0.05且q<0.05，和Fold Change大于2倍及小于0.5倍的差異基因。如圖1和表2所示，Dox組與正常組進行比較得到3 582個差異基因，其中上調基因647個，下調基因2 935個；Lut加Dox組與Dox組進行比較得到1 981個差異基因，其中上調基因1 811個，下調基因170個。為了找到與用藥相關的差異基因，選取Dox組對比正常組中上調且Dox加Lut組對比Dox組下調的123個基因；選取Dox組對比正常組中下調且Dox加Lut組對比Dox組上調的814個基因(圖2)對以上的交集基因進行分析。分析后發現，與正常組相比，Dox組MIEF1基因被顯著下調；而經過Lut治療后，與Dox組相比，MIEF1基因表達水平得到恢復。因此，后期實驗選擇MIEF1作為Lut改善H9c2心肌細胞損傷的靶點基因。

圖1 細胞差異基因散點圖Fig.1 Scatter plot of differentially expressed genes in cells注：A：Dox組vs正常組；B：Dox+Lut 組vs Dox 組。Note:A:Dox group vs normal group;B:Dox+Lut group vs Dox group.

表2 細胞差異表達基因Table 2 Differentially expressed genes in cells

圖2 細胞交集基因韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection gene

3.3 低表達MIEF1的H9c2細胞的驗證

MIEF1-siRNA轉染H9c2細胞24 h后，Western blot 檢測細胞MIEF1蛋白表達水平。MIEF1siRNA轉染后，與野生型及空載體siRNA細胞相比，siRNA-MIEF1 1號細胞MIEF1蛋白的表達水平降低最為明顯，轉染效率最高(P<0.05)。RT-PCR實驗證明，與正常組細胞相比，siRNA-MIEF1 1號轉染后的細胞MIEF1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)。說明低表達MIEF1的H9c2細胞構建成功(見表3、表4、圖3)。

圖3 轉染后細胞中MIEF1蛋白表達電泳Fig.3 Electrophoresis of MIEF1 protein expression after transfection注：A：正常組；B：siRNA-空白；C：siRNA-MIEF1#1；D：siRNA-MIEF1#2；E：siRNA-MIEF1#3。Note:A:Normal group;B:siRNA-control;C:siRNA-MIEF1#1;D:siRNA-MIEF1#2;E:siRNA-MIEF1#3.

表3 轉染后細胞中MIEF1蛋白表達

注：與正常組比較，*P<0.05。

Note:Compared with the normal group,*P<0.05.

組別 GroupmRNA表達量mRNA expression正常NormalsiRNA- MIEF1#11.08±0.080.51±0.02*

注：與正常組比較，*P<0.05。

Note:Compared with the normal group,*P<0.05.

3.4 Lut對H9c2細胞MIEF1、p-Drp1(Ser637)、Caspase-3蛋白影響

與Dox組相比，siRNA+Dox組MIEF1、p-Drp1(Ser637)蛋白水平降低(P< 0.05)，Caspase-3蛋白的表達水平增加(P< 0.05)。Lut+ siRNA+Dox組與siRNA+Dox組相比，MIEF1、p-Drp1(Ser637)蛋白水平上升(P< 0.05)，Caspase-3蛋白的表達水平降低(P< 0.05)(見表5和圖4)。

4 討論

阿霉素(doxorubicin，Dox)又稱多柔比星，屬蒽環類抗生素，被應用于多種惡性腫瘤的治療，但因其出現劑量依賴性心臟毒性，限制了其臨床應用。蒽環類藥物致心臟損傷的確切機制目前尚不清楚[11,12]，因此尋找阿霉素心臟毒性的分子靶標，研發有效的抗阿霉素心臟毒性的藥物尤為重要。

圖4 細胞中MIEF1、p-Drp1(Ser637)、Caspase-3蛋白表達電泳Fig.4 Electrophoresis of MIEF1,p-Drp1(Ser637),Caspase-3 protein expression in cells注：A：正常組； B：siRNA+Dox組； C：Dox組；D：Lut+siRNA+Dox組。Note:A:Normal group;B:siRNA+Dox group;C:Dox group;D:Lut+siRNA+Dox group.

表5 Lut對H9c2細胞MIEF1、p-Drp1(Ser637)、Caspase-3蛋白影響Table 5 Effect of Luteolin on MIEF1,p-Drp1(Ser637),Caspase-3 protein expression in H9c2 cells ± s,n = 3)

注：與Dox組比較，*P<0.05；與siRNA+Dox組比，#P<0.05。

Note:Compared with the Dox group,*P<0.05;Compared with the siRNA+Dox group,#P<0.05.

目前，越來越多的學者發現，中藥復方及所含活性成分能有效保護蒽環類藥物對心臟的損傷[13,14]。線粒體是細胞的“能量工廠”，在所有細胞中心肌細胞是含線粒體最多的細胞。線粒體形態和功能對于維持正常的心臟生理功能至關重要[15]。研究表明，線粒體是一個動態變化的細胞器，其通過不斷地融合與分裂以維持自身穩態。當心肌細胞線粒體融合或分裂過程失衡時，則會引起自身形態及功能紊亂，進而導致心臟功能損害[16]。研究報道，在細胞凋亡早期，線粒體出現了斷裂以及嵴重構，線粒體融合、分裂調控蛋白也積極參與了細胞凋亡過程。同時，Tang等[17]研究發現，阿霉素可導致心肌細胞線粒體過度分裂從而導致細胞發生凋亡。MIEF1，又稱MiD51，是一種參與調控線粒體融合分裂的重要分子，位于線粒體外膜上[18]，其作用是通過招募下游動力相關蛋白1(Drp1)到線粒體上，使得Drp1在Ser637位點發生磷酸化[19]，從而抑制細胞線粒體過度分裂，減少細胞凋亡[20]。研究報道，在利用CRISPR/cas9技術敲除MIEF1的293T細胞中，線粒體過度分裂，細胞線粒體功能遭到破壞[21]。由此可見，MIEF1在調控線粒體融合分裂方面發揮了舉足輕重的作用。

本研究發現，Lut作用阿霉素誘導的心肌細胞后，細胞活力得到明顯提升。轉錄組學結果提示，阿霉素作用細胞后，MIEF1表達水平明顯下調，而經過Lut干預后，MIEF1水平又得到了恢復提升，因此確定MIEF1可能是木犀草素發揮抗心臟毒性作用的潛在靶點。利用分子生物學技術降低MIEF1蛋白及mRNA水平，通過Western blot 檢測下游p-Drp1(Ser637)及細胞凋亡經典通路蛋白Caspase-3水平后發現，1 μM阿霉素作用心肌細胞時，與正常組相比，并未引起Caspase-3及其他蛋白顯著的變化。而Lut能夠提高低表達MIEF1細胞線粒體MIEF1蛋白的表達，促進Drp1蛋白在Ser637位點的磷酸化，進而阻止線粒體的過度分裂，抑制線粒體Caspase-3凋亡信號通路的激活。以上實驗闡釋了木犀草素心肌保護的部分作用機制，但其在降低線粒體過度分裂的過程中是否有其他信號途徑參與，有待進一步研究。