應用于天然產物抗炎活性研究的主要細胞模型

劉燕芳，劉 丹，劉 蘭，張 敉

昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650500

炎癥是人體為了抵御有害刺激并修復受損組織而產生的一種防御反應。據流行病學和臨床資料顯示，過度的炎癥反應會反噬機體，造成二次病理損傷。研究表明：炎癥不僅參與多種疾病的發生發展，包括我們熟知的類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化[1]、神經炎、哮喘[2]、炎性腸疾病和腎小球腎炎等疾病[3]，還可引發自身免疫疾病及癌癥，并加速這類疾病的發展[4]。因此，研究和開發具有抗炎作用的藥物具有重大意義。

先導化合物的發現是藥物研究的重要階段之一。這一階段離不開靈敏、快速、經濟、高效的藥理模型來進行潛在的先導化合物的活性篩選。最早的篩選模型主要以動物為基礎，可以得到大量的體內實驗數據，但考慮到在利用動物模型進行篩選時，勞動密集耗費時間、經濟成本高且不利于大規模篩選等因素，同時，動物模型篩選所需樣品量較大，而實際工作中大部分先導化合物的前體往往來源于天然產物，它們相較于合成產物而言可謂是極微量的，所以，隨著現代藥理學的發展，先導化合物的高通量篩選已經更多轉向了細胞水平。細胞模型兼具靈敏、快速、經濟、高效的特點，重要的是其所需樣品量小，更適合于天然產物的活性篩選。

本文綜述了目前廣泛用于篩選具有抗炎活性天然產物的細胞模型，以期為該類天然先導化合物的研究與開發提供一定參考。

1 單核/巨噬細胞模型

巨噬細胞是從血液中的單核細胞分化而來，可以發揮多種功能，包括呈現抗原、清除微生物和腫瘤細胞以及組織重塑。巨噬細胞具有廣泛的病原體識別受體，通過吞噬和識別病原體相關分子模式參與先天和適應性免疫應答[5]；作為分泌細胞，可以通過激活機體的免疫系統，釋放細胞因子，如一氧化氮(NO)、TNF-α、白細胞介素(IL-1、IL-6)等[6]；通過識別表面的特異性抗原，參與T輔助細胞(Th)的激活和炎癥細胞因子和趨化因子的產生[7]。巨噬細胞還分泌粘附分子，這些分子促使淋巴細胞浸潤到炎癥病變部位，參與炎癥過程。以下將介紹幾種常見的單核/巨噬細胞炎癥模型。

1.1 小鼠巨噬細胞RAW264.7模型

RAW264.7是由Abelson鼠白血病病毒誘導BALB/c小鼠產生腫瘤后收集小鼠腹水單核樣巨噬細胞得到的細胞株(ATCC Number：TIB-71)。RAW264.7細胞一般為圓形或橢圓形，功能活躍時，可呈多突形。對空間很敏感，喜聚集，成片生長，易吞噬抗原、易老化、易發生形態的變異，等長到更多更密時連成大片，并且會疊加成層。該細胞具有很強的黏附和吞噬抗原的能力，在炎癥反應、免疫反應和吞噬反應中發揮著關鍵的作用，是微生物學、免疫學研究中的常用細胞株[8，9]。免疫學研究中常采用脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激RAW264.7細胞構建炎癥反應模型，該細胞模型穩定，模型組和空白組的對比明顯，促炎細胞因子和抗炎細胞因子的分泌變化顯著。例如細胞上清中IL-4、IL-6、TNF-α、NO、前列腺素E2(PGE2)等炎癥因子含量明顯上升。因此，可利用該模型進行炎癥活性篩選和機制的研究。

目前，天然產物的抗炎活性，以LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞作為篩選模型應用非常廣泛。通過評價藥物對NO釋放的影響、以及通過ELISA和Western blotting分析相關炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2等)和蛋白(誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環氧化酶(COX-2)等) 表達水平，是判斷天然產物是否具有潛在的抗炎活性的有效手段。目前，利用該模型，已從很多天然藥物中發現一系列活性先導化合物。例如，從荔枝草[10]中分離得到的倍半萜，在LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型中通過抑制NF-κB和細胞外調節蛋白激酶(Erk1/2)信號通路表現出抗炎效果[11]。Shin 等[12]通過該模型研究發現，大薊中的薊黃素可抑制IL-6、TNF-α和NO產生，以及LPS誘導的轉錄因子如c-fos和信號轉導以及轉錄激活因子3(STAT3)的活化，表現出顯著的抗炎活性。從茵陳蒿中提取的精油能顯著抑制LPS刺激RAW264.7細胞中NO的產生，研究表明該精油是通過阻斷絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)介導的途徑并抑制NF-κB的活化來抑制炎癥介質的表達和產生[13]。中藥連翹[14]中的連翹脂素可以抑制LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO、TNF-α和IL-6，并呈濃度依賴性下調COX-2和iNOS的蛋白表達[15]。從大葉山楝的根皮中提取的二萜二聚體對LPS誘導RAW264.7細胞產生的NO表現出顯著的抑制作用[16]。初步統計，利用該模型篩選過的天然產物已超過5萬。

1.2 小鼠巨噬細胞BMDM模型

骨髓來源巨噬細胞BMDM(bone marrow derived macrophage)通常是將C57BL/6小鼠的骨髓分離后收集，利用巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)誘導分化得到的[17-19]。呈不規則形或梭形，相比其他原代細胞，BMDM是均質的，具有增殖能力，可轉染，并且壽命超過一周。目前，BMDM作為原代巨噬細胞，直接來源于機體組織，當生物性狀尚未發生較大變化時，在一定程度上能反映體內狀態，因此成為活性篩選和機制研究的良好模型。BMDM還可以用作原代細胞培養系統研究體外基因功能(例如消除轉基因小鼠中的基因表達)，分析擴散改變、功能和基因表達[20]。另外，巨噬細胞是免疫系統中的特化細胞，執行許多任務如吞噬、抗原呈遞、細胞因子產生和遷移等，這也是大多數免疫學研究選擇BMDM作為炎癥模型的主要原因[21]。

LPS誘導的基因表達在BMDM中具有高度選擇性，研究表明多個轉錄因子家族可能都參與了BMDM的調控[22]。Ji等[23]利用LPS刺激BMMD細胞建立的體外炎癥模型，研究了桃金娘科植物藍桉總提物的活性，結果顯示，該提取物可通過減弱IL-1β來抑制單鈉尿酸鹽 (MSU)誘導的腹膜炎，為其傳統應用提供了科學支持。Lee等[24]利用偶發分枝桿菌感染BMDM細胞引起炎癥反應的細胞模型研究發現，Toll樣受體2(TLR2)-髓樣分化初級應答基因88的信號傳導可觸發BMDM中TNF-α和IL-6的表達，并快速誘導炎癥因子A20 (TNFAIP3)的表達。另有研究發現，中藥黃芪[25]可抑制LPS刺激BMDM促炎因子TNF-α、IL-6的產生[26]，樺木科的昌化鵝耳櫪葉的甲醇提取物對R848(Toll-like receptor7/8激動劑)刺激的BMDM細胞產生的促炎細胞因子IL-12 p40、IL-6和TNF-α具有劑量依賴性抑制作用[27]。

1.3 J774A.1細胞模型

小鼠單核巨噬細胞J774A.1來源于BABL/cN小鼠，屬于貼壁細胞，呈圓形或橢圓形，有抗體依賴的吞噬作用，硫酸葡聚糖、PPD和LPS可抑制其生長，并產生IL-1β和大量的溶菌酶。J774A.1細胞是免疫系統中功能多樣的效應細胞，在炎癥反應的不同階段發揮著不同甚至相反的功能[28]。

1.4 NR8383細胞模型

NR8383細胞來源于正常大鼠肺灌洗時的肺泡巨噬細胞[35]，屬半懸浮細胞，呈圓形或橢圓形。NR8383細胞作為高響應肺泡巨噬細胞的均一來源，可以用于巨噬細胞相關活性的體外研究，尤其是肺部炎癥[36,37]。NR8383細胞在博萊霉素刺激下，會分泌TNF-β前體，且TNF-βmRNA表達也會上升；NR8383細胞對內毒素也很敏感，10 ng/mL的LPS對該細胞的增生抑制率可達50%。

黃芩具有多種生物活性[38]，利用NR8383細胞炎癥模型，發現其中的漢黃芩素能夠抑制TNF-α和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的轉錄和表達，降低PGE2、磷脂酶A2(PLA2)、白三烯B4(LTB4)、丙二醛(MDA)的濃度以及NO的產生和iNOS的活性，并通過抑制Toll樣受體(TLR7)介導的髓樣分化因子(MyD88)依賴性信號通路NF-κB的核轉位和表達來減少流感感染的炎癥反應[39,40]。有文獻[41]報道，鼠麴草能夠降低LPS刺激的NR8383細胞中的NO水平，同時降低TNF-α、IL-1β和COX-2的水平,以及降低NR8383細胞中磷酸化的p65和IκBα的水平。此外，利用該模型研究發現冬蟲夏草菌絲體甲醇提取物可拮抗LPS誘導的NR8383細胞中p38和IκB磷酸化，下調p-p38和p-IκB水平，并阻滯LPS誘導的NF-κB的核轉位，下調LPS誘導的iNOS和PGE2合成限速酶的高表達，對炎癥反應表現出抑制活性[42]。

1.5 THP-1細胞模型

THP-1來源于急性單核細胞白血病患者的人單核細胞系，在一定劑量的佛波酯(PMA)誘導下成為成熟的THP-1巨噬細胞，由懸浮狀轉變為貼壁狀，細胞形態由圓形轉變為梭形、不規則形、橢圓形。當THP-1細胞受到LPS刺激后，THP-l細胞內NF-κB，MAPKs通路活化，p-ERK、p-p38、p-JNK、p-IKBα表達明顯增加，相應的ERK、p38、JNK、IKB表達下降，并產生大量細胞炎癥因子(IL-1β、 IL-6、IL-8和TNF-α)[43-45]。TNF-α作為細胞因子產生的誘導劑，其在10 pM的濃度下也可以誘導該細胞內NF-κB的活化[46]，因此，該細胞炎癥模型可應用于藥物的抗炎作用研究。

Wang等[47]以THP-1細胞為載體，研究荊芥揮發油抗炎作用及與NLRP3炎癥小體激活相關的調控作用機制，發現荊芥揮發油能抑制ATP、Nigericin、CPPD 或CaCl2誘導的THP-1 巨噬細胞IL-1β高分泌，抑制ATP或Nigericin誘導下THP-1巨噬細胞裂解液中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的高表達，其抗炎作用的發揮與干預NLRP3炎癥小體的激活有關。突尼斯木瓜果皮中的多酚提取物通過調節THP-1細胞中蛋白激酶B(Akt)、p38MAPK、NF-κB三種信號通路來達到抗炎效果的[48]。另有研究表明，丹參[49]中的紫草酸和丹酚酸B可顯著下調LPS誘導的THP-1細胞中TLR4、p-p65和p-IκBα的表達[50]；白花丹參根提取中的丹參酮能顯著抑制LPS刺激的THP-1細胞中的TNF-α、IL-1β和IL-8的mRNA[51]。該細胞具有更類似于人原代單核細胞的表型及功能特征，又具有比人原代單核細胞如外周血單個核細胞更廣泛且穩定的來源和基因背景，故是迄今研究人原代單核細胞/巨噬細胞功能應用最普遍的體外模型細胞[52-54]。

2 中性粒細胞模型

中性粒細胞(neutrophil)來源于骨髓的造血干細胞，該細胞核呈桿狀或2～5分葉狀，葉與葉間有細絲相連，胞漿內含有大量既不嗜堿也不嗜酸的中性細顆粒。這些顆粒多是溶酶體，內含髓過氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性水解酶等豐富的酶類，與細胞的吞噬和消化功能有關，在瑞氏(Wright)染色血涂片中，胞質呈無色或極淺的淡紅色，有許多彌散分布的細小的(0.2～0.4微米)淺紅或淺紫色的特有顆粒。中性粒細胞具趨化作用、吞噬作用和殺菌作用。嗜中性粒細胞被認為是急性炎癥的中樞細胞，在發炎過程中，可明顯觀察到嗜中性粒細胞的數量、壽命、活動性、組織流入能力和吞噬能力的增加[55,56]。

多形核中性粒細胞(polymophnuclear leulocyte，PMN)是一種小吞噬細胞，在發揮防御作用時，其胞漿內的細胞毒性物質既可殺傷外來入侵的病原微生物，也可造成自身組織的損傷。其自發性凋亡的機制既避免了炎癥反應擴大化，又減少了自身組織細胞損傷[57]。炎癥反應發生時，其體內溶酶體以脫顆粒的形式釋放多種酶，這些酶可被選擇性的釋放到胞外，其中最主要的為彈性蛋白酶。中性粒細胞彈性蛋白酶(enutorphil elastase，NE)即由中性粒細胞所釋放，是絲氨酸蛋白酶家族的重要成員，對炎癥的發生及病原菌的清除具有重要作用。它為一種雜食性酶，可溶解多種蛋白，但最適底物是彈性蛋白。NE具有雙重作用，生理條件下，NE參與調節炎性反應，促進吞噬細胞消除有害病菌，構成機體防御系統的重要部分。但是，炎癥情況下，過量釋放NE能降解膠原蛋白、層粘連蛋白和其他內皮組織的細胞外基質，增加組織通透性，促進中性粒細胞滲出，炎性因子釋放，降解細胞基質，催化caspase-3誘導的細胞凋亡。NE的活性受到多種蛋白酶抑制劑的調控[58]。中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑(neutrophil elastase inhibitors，NEI)抑制NE活性，調節炎性細胞因子和趨化因子的釋放，抑制炎細胞激活、跨膜遷移及組織毒性物質釋放，發揮多層次的抗炎效應，并能調節機體先天免疫功能。因此，篩選具有NE抑制功能NEI的是發現具有抗炎活性的天然產物的有效手段。

Granica等[59]利用LPS刺激從人的血液中分離的中性粒細胞，建立了體外炎癥模型，通過ELISA的方法，篩選出對口腔炎癥(包括粘膜炎，牙齦炎和牙周病)具有顯著療效的天然成分——木水楊梅根的提取物及其主要成分水楊梅鞣質(gemin A)，并且發現gemin A通過減少黏附分子CD11b的表面表達，抑制活性氧和蛋白酶(彈性蛋白酶，MMP-9)，趨化因子和細胞因子(IL-8和 IL-1β)的釋放，顯著影響到由LPS刺激的嗜中性粒細胞的功能。此外，在Gomes等[60]人對N-甲酰甲硫氨酸-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)觸發的嗜中性粒細胞進行體外趨化性的研究中發現，桃金娘烯醇相對于施用角叉菜膠的賦形劑組對細胞遷移有所改善，可阻止fMLP引發的嗜中性粒細胞趨化性。因此，建立中性粒細胞體外炎癥模型，尋找有效的彈性蛋白酶抑制劑治療炎癥相關疾病，是一種有前景的方法。

3 其他類型細胞模型

3.1 P388D1細胞模型

小鼠淋巴瘤細胞(P388D1)來源于甲基膽蒽誘導形成的淋巴瘤，呈淋巴母細胞樣，懸浮生長。在LPS和佛波酯的誘導下，該細胞可以產生IL-1和溶菌酶，并可以吞噬酵母多糖和乳膠微球。P388D1細胞可分泌彈性蛋白酶，膠原酶和纖溶酶原激活劑，其活性與體內炎性刺激引起的巨噬細胞活性相當。研究表明，抗炎性糖皮質激素可選擇性和可逆的抑制P388D1細胞3種蛋白酶的分泌，但不抑制由該細胞產生的組成型溶菌酶的分泌。每個P388D1細胞約含有4 000個可飽和的糖皮質激素結合位點，糖皮質激素與P388D1細胞系之間的這種相互作用為建立基于中性蛋白酶分泌調節的巨噬細胞模型[61]提供了基礎。

3.2 L929細胞模型

成纖維上皮細胞(L929)是從雄性C3H/An小鼠的正常皮下疏松結締組織入脂肪組織中建立了親本細胞系，經毛細管法分離單細胞而得到的。細胞貼壁生長，呈梭形或短梭形，細胞核呈圓形或卵圓形，核較小，單層生長，細胞質嗜弱堿性，集落清晰，形態分為致密型和疏散型兩種[62]，并且增殖速度快，耐受力強，易接受轉染。作為TNF-α細胞毒作用的敏感靶細胞，可用于篩選TNF-α的拮抗劑來研究抗炎藥物。

Tian等[63]以LPS為刺激物建立L929細胞體外炎癥模型，發現木瓜的乙酸乙酯部位具有良好的抗炎作用。在Oh等[64]的研究中，用干擾素-γ處理小鼠成纖維細胞L929細胞，繼而導致過量的NO生成和iNOS基因表達，利用該模型篩選發現視黃酸可顯著抑制NO生成和iNOS基因表達，并呈劑量依賴性，同時，9-順式-視黃酸也會抑制NO的生成。另有研究發現，脂質體制劑對作為線粒體代謝評估的L929成纖維細胞活力具有正面影響，包埋脂質體的硫酸軟骨素可有效降低H2O2刺激的L929成纖維細胞中TNF-α的產生并且具有與抑制IL-8相似的活性[65]。成纖維細胞增殖是組織再生傷口愈合中的重要步驟。心葉凹唇姜根莖的氯仿提取物可顯著增強L929成纖維細胞生長，通過劃痕試驗，還觀察到其乙醇提取物及其中組分對L929的遷移效果也顯著增強，即心葉凹唇姜根莖的氯仿和乙醇部位可參與成纖維細胞的增殖和遷移，并刺激膠原蛋白的生產，且具有抗炎作用，是創傷愈合增強的重要因素[66]。此外，通過TNF-α誘導的L929細胞模型發現：竹黃抑制該模型COX-2蛋白的表達，并在一定濃度范圍內誘導BCL-2表達上調，其中的有效成分主要通過COX-2、BCL-2信號途徑影響TNF-α信號網絡[67]。實際上，L929細胞是一株對TNF-α高度敏感的細胞株。從旋覆花中分離得到的倍半萜內酯二聚體可與TNF-α直接結合，選擇性抑制TNF-α與Ⅰ型受體(TNFR1)的相互作用，在TNF-α刺激的細胞中有效地阻斷TNFR1介導的信號，在體外拮抗TNF-α的促炎活性[68]，從而發揮抗炎作用。

3.3 小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3模型

NIH/3T3細胞是從Swiss小鼠胚胎培養物中建立的高度接觸性抑制的胚胎成纖維細胞系，呈纖維細胞樣，貼壁生長。該細胞對肉瘤病毒轉化灶形成和白血病病毒的繁殖高度敏感，對DNA轉化及轉染研究十分有用，并且在基礎醫學和臨床醫學研究中較廣泛的運用于各種外來因子對細胞的損傷或修復研究。TNF-α能刺激該細胞的增殖并能上調其中Syndencan-4蛋白的表達，介導炎癥反應[69,70]。

從杏香兔耳風中分離得到的木犀草素、木犀草苷、綠原酸、3，5-二咖啡酰基奎寧酸和4，5-二咖啡酰基奎寧酸五種中藥單體可濃度依賴性降低細胞內PGE2的生成，且濃度越大，PGE2的含量越低[71]。有文獻[72]報道，白藜蘆醇是一種有效的組蛋白去乙酰化酶(Sirt1)激活劑，具有抗炎作用，利用該模型研究發現其抗炎活性主要依賴于Sirt1和Sirt1對炎癥產生負面調節而發揮作用。

4 結論

炎癥是身體對于有害的刺激和條件引起的適應性反應。在生理條件下，炎癥能夠消除感染、修復機體，可防止進一步的損傷；在病理條件下，炎癥可導致組織破壞和器官功能障礙，這在許多人類疾病的發展中起著重要作用。炎癥是先天免疫系統對有害刺激，組織損傷或感染的復雜生物反應，其特征在于熱、腫脹、發紅、疼痛和功能障礙[73]。然而，慢性炎癥已被認為是包括動脈硬化、神經退行性疾病、哮喘和癌癥在內的多種疾病的常見原因[74-77]。

很多天然藥物具有良好的抗炎效果，且資源豐富、副作用小、應用歷史悠久，因此具有很好的開發價值和前景，選擇合適的篩選模型尤為重要。由于動物模型篩選抗炎藥物存在規模小、成本高、耗時長，尤其是對樣品的需求較大等不利因素，而細胞模型快速、高效、成本低，且能對藥物作用的分子靶點及機制做出解釋，因此細胞模型在篩選抗炎藥物的過程中顯得極其重要。以往的綜述主要集中在天然藥物的抗炎機制方面，但有關抗炎天然藥物細胞篩選模型的總結很少有報道，本文綜述了近年來在抗炎藥物篩選過程中應用的一些細胞模型，以期為天然藥物的抗炎活性及機制研究提供參考。