臺(tái)灣榿木DNA提取方法的優(yōu)化及抗氧化劑對(duì)DNA質(zhì)量的影響

劉佳哲， 申文輝，譚長(zhǎng)強(qiáng)，滕維超

(1.廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530002；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530002)

1 引言

近年來(lái)植物種質(zhì)資源信息系統(tǒng)的建立，基因資源庫(kù)的完善，以及分子標(biāo)記在生物學(xué)上的廣泛應(yīng)用，都離不開(kāi)DNA的提取[1]。高質(zhì)量的DNA提取對(duì)于基因組測(cè)序、PCR反應(yīng)、基因克隆、酶切等試驗(yàn)至關(guān)重要[2]。從植物體內(nèi)提取DNA是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)，但不同植物甚至是同種植物的不同部位提取的DNA質(zhì)量都會(huì)有一定差異。因此為提取出高質(zhì)量的DNA，需要對(duì)現(xiàn)有的方法進(jìn)行一定的優(yōu)化[3]。目前常使用提取DNA的方法有CTAB法、SDS法和高鹽低pH法等[4]，本研究采用成本低廉操作相對(duì)簡(jiǎn)易的CTAB法和SDS法進(jìn)行研究。

臺(tái)灣榿木(Aluusformosaua)原產(chǎn)中國(guó)臺(tái)灣，是樺木科(Betμlaeeae)，榿木屬(Aluus)的落葉大喬木[5]。引種大陸以來(lái)，臺(tái)灣榿木具有適應(yīng)性較好以及生長(zhǎng)速度快的優(yōu)點(diǎn)[6]。但由于林木周期較長(zhǎng)，目前主要研究?jī)?nèi)容為引種栽培、生長(zhǎng)光合、根瘤形態(tài)等方面[7]，分子標(biāo)記對(duì)林業(yè)優(yōu)良家系的選擇以及提高林業(yè)生產(chǎn)效率具有積極作用[7]。臺(tái)灣榿木由于葉片內(nèi)含豐富的多糖、多酚類(lèi)等影響DNA提取質(zhì)量的次生物質(zhì)，這些物質(zhì)在植物組織的破碎過(guò)程中與空氣接觸被迅速氧化，影響到DNA的提取率[8]。而分子標(biāo)記通常需要大量樣品進(jìn)行分析，一種高效簡(jiǎn)易的DNA提取方法對(duì)于臺(tái)灣榿木的遺傳研究至關(guān)重要。抗壞血酸和β-巰基乙醇都是常用的抗氧化劑，對(duì)此本研究采用兩種不同方式提取DNA的質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比，以及添加不同抗氧化劑對(duì)DNA質(zhì)量的影響進(jìn)行探究，以期獲得高質(zhì)量的DNA為后續(xù)試驗(yàn)提供材料。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自廣西黃冕林場(chǎng)波寨分場(chǎng)臺(tái)灣榿木試驗(yàn)林，試驗(yàn)林苗木樹(shù)齡3年，平均樹(shù)高5.37 m，平均胸徑5.43 cm。選擇健康植株的新生幼葉作為DNA提取材料。試驗(yàn)地位于廣西桂林市永福縣波寨(106°45′E,21°54′N(xiāo))，為低山丘陵地貌，海拔約300 m，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候。常年氣溫溫暖，降雨充沛，陽(yáng)光充足。年均氣溫19 ℃，絕對(duì)最低溫-2.8 ℃，年均降水量1800 mm，降雨集中在4～8月。成土母巖以砂頁(yè)巖、夾泥巖為主，土壤以紅壤為主，表土層厚度20～25 cm，土層厚50～70 cm，pH值5.8。為桉樹(shù)人工林采伐跡地。使用福建、湖南、昭新、昭南、昭衛(wèi)和什邡共6個(gè)種源(表1)的臺(tái)灣榿木幼葉作為優(yōu)化后DNA提取方法的驗(yàn)證材料。幼葉采集后迅速放入變色硅膠中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 DNA提取試驗(yàn)方法

本研究采用兩種DNA提取方法對(duì)比，抗氧化劑選擇抗壞血酸和β-巰基乙醇兩種，每種抗氧化劑濃度設(shè)置3個(gè)梯度(表2)，在兩種DNA提取方法上分別采用不同濃度的抗氧化劑進(jìn)行試驗(yàn)。DNA提取方法采用改良CTAB法和改良SDS法。

表1 臺(tái)灣榿木種源來(lái)源

表2 不同DNA提取方法和抗氧化劑處理梯度

2.2.1 改良CTAB提取法

取少量實(shí)驗(yàn)材料(約300 mg)置于研缽中，加入適量的抗壞血酸(表2)后，加入3 mL在65 ℃水浴預(yù)熱的2%CTAB抽提緩沖液(含5% PVP)，研磨至勻漿狀；將充分研磨的勻漿取1.2 mL倒入2.0 mL的滅菌離心管中；同時(shí)加入適量的β-巰基乙醇(表1)；置于65 ℃的水浴鍋或恒溫箱中，每隔10 min輕輕搖動(dòng)，45 min后取出；冷卻2 min后，加入氯仿-異戊醇(24∶1)至滿管，振蕩2 min(注意不要?jiǎng)×艺鹗帲瑫?huì)使基因組斷裂)，使兩者混合均勻；放入離心機(jī)中12000 r/min離心10 min；離心后輕柔取出離心管，使用移液器輕緩吸取約700μL上清液至新離心管中，再加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，重復(fù)上述步驟；使用移液器輕輕地吸取400μL上清液至新離心管中，加入270μL -20℃預(yù)冷的異丙醇，將離心管蓋穩(wěn)后慢慢上下?lián)u動(dòng)30 s，使異丙醇與水層充分混合至能見(jiàn)到DNA絮狀物(若搖動(dòng)后不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的DNA絮狀物可以放入-20 ℃冰箱冷凍1 h)；將離心管放入小型桌面離心機(jī)10000 r/min離心1 min后，倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出；再加入1mL 75%乙醇，上下顛倒離心管使乙醇與DNA充分接觸后倒出，重復(fù)此操作2次；將離心管倒立于鋪開(kāi)的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA(自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干)；加入200 μL 1 × TE，使DNA溶解后放置-20 ℃冰箱保存。

2.2.2 改良SDS提取法

改良SDS法與改良CTAB法步驟基本一致，區(qū)別在于提取液使用3%SDS提取液，研磨后取1 mL勻漿65 ℃水浴45 min，水浴后加入200μL KAc并在冰上靜置30 min。

2.3 DNA質(zhì)量的檢測(cè)

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳120V，20 min，使用超靈敏多功能成像儀拍照。使用超微量核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA的濃度和純度。最后將最佳DNA提取方法和抗氧化劑最適濃度下提取的DNA進(jìn)行SSR分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增，使用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后觀察條帶。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同DNA提取方法對(duì)DNA質(zhì)量的影響

CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，可以有效去除植物葉片內(nèi)的多糖成分，SDS是一種陰離子去污劑，可以有效與植物組織內(nèi)的蛋白結(jié)合起到去除蛋白的作用。兩種方法都可以提取出一定量的DNA，從電泳結(jié)果上看(圖1)，CTAB法提取的DNA條帶相對(duì)較亮較寬，SDS法提取的DNA條帶較暗，說(shuō)明CTAB法提取的DNA中蛋白雜質(zhì)比SDS法提取的多，兩種方式提取的DNA均有一定程度的拖尾，說(shuō)明DNA發(fā)生降解或者是存在小分子雜質(zhì)。使用超微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定DNA濃度和純度，CTAB法提取的DNA濃度平均為478.5 ng/μL，OD260/OD230在1.84～1.92之間，說(shuō)明仍存在少量的蛋白雜質(zhì)、RNA和小分子雜質(zhì)等；SDS法提取的DNA濃度平均為280.3 ng/μL，OD260/OD230在1.64～1.86之間，也存在雜質(zhì)的污染。

使用CTAB法和SDS法研磨葉片后勻漿均呈黃褐色。加入CTAB提取液后研磨幾乎無(wú)泡沫產(chǎn)生，離心后可產(chǎn)生足量的上清液以供后續(xù)步驟操作。加入SDS提取液后研磨會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，泡沫會(huì)導(dǎo)致無(wú)法將研磨后的勻漿充分轉(zhuǎn)移到離心管中。從沉淀的樣品中發(fā)現(xiàn)，使用CTAB法提取的DNA絮狀沉淀呈黃褐色，但SDS法提取的DNA呈黃白色。使用200 μL TE溶解晾干DNA樣品后發(fā)現(xiàn)所有DNA樣品難溶，說(shuō)明無(wú)論是CTAB法還是SDS法，在不加抗氧化劑的情況下提取出的DNA的質(zhì)量均不佳，其中混雜有一定的雜質(zhì)導(dǎo)致無(wú)法溶解。

3.2 不同抗氧化劑對(duì)臺(tái)灣榿木DNA質(zhì)量的影響

抗氧化劑在DNA提取過(guò)程中可以起到防止酚類(lèi)物質(zhì)被氧化成醌以及防止植物組織的褐變。在上述試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不添加抗氧化劑的情況下，臺(tái)灣榿木很容易被氧化成褐色，使用氯仿抽提也無(wú)法去除附著的色素，導(dǎo)致DNA沉淀呈黃(紅)褐色狀態(tài)。本研究采用β-巰基乙醇和抗壞血酸兩種抗氧化劑對(duì)比(圖1)，結(jié)果表明：在CTAB法或SDS法中使用β-巰基乙醇可以有效防止褐變，抗壞血酸也可以防止樣品的褐變但高濃度的抗壞血酸會(huì)導(dǎo)致DNA的降解。從電泳圖中可以看出使用β-巰基乙醇的量與DNA質(zhì)量沒(méi)有明顯差異，但使用抗壞血酸的樣品出現(xiàn)隨著抗壞血酸濃度的增加而降解的情況。當(dāng)抗壞血酸用量為0.015 g時(shí)效果最好，既能防止樣品的氧化褐變，又不會(huì)導(dǎo)致DNA的降解。抗壞血酸用量為0.05 g時(shí)無(wú)論是SDS法還是CTAB法提取的DNA幾乎都被完全降解。

添加抗壞血酸的樣品在研磨過(guò)程中樣品始終保持新鮮青綠色狀態(tài)，水浴45 min后仍保持鮮綠色，使用氯仿抽提后的上清液也呈略帶黃綠的澄清液體，最后使用異丙醇沉淀時(shí)得到白色且易溶于TE的絮狀DNA沉淀。β-巰基乙醇是在65 ℃水浴前在離心管中加入后混勻，因此在研磨過(guò)程中不可避免的樣品已經(jīng)被氧化為黃褐色。加入β-巰基乙醇混勻水浴45 min后黃褐色的樣品勻漿被還原為黃綠色，使用氯仿抽提后的上清液呈黃綠色較抗壞血酸處理的上清液顏色更深，最后使用異丙醇沉淀后可得到淡黃近白色且可溶于TE的DNA絮狀沉淀。

圖1不同濃度-巰基乙醇和抗壞血酸在兩種DNA提取方法提取DNA電泳圖

3.3 SSR-PCR擴(kuò)增檢測(cè)DNA提取質(zhì)量

本研究發(fā)現(xiàn)使用SDS法提取的DNA得率比CTAB法要低，質(zhì)量稍微欠佳，雖然可以滿足部分分子標(biāo)記的使用，若是進(jìn)行測(cè)序等試驗(yàn)還略有欠佳。在研磨過(guò)程中SDS提取液會(huì)與樣品產(chǎn)生大量泡沫，大量泡沫會(huì)導(dǎo)致無(wú)法充分的將研磨液從研缽中轉(zhuǎn)移到離心管中，CTAB提取液則無(wú)泡沫產(chǎn)生。因此無(wú)論是DNA得率和質(zhì)量，還是操作的高效性，CTAB法更適合臺(tái)灣榿木DNA的提取。在抗氧化劑的選擇上，采用抗壞血酸作為抗氧化劑時(shí)存在高濃度會(huì)導(dǎo)致DNA降解(圖1)，而采用β-巰基乙醇不會(huì)導(dǎo)致DNA的降解。β-巰基乙醇作為一種液體試劑，相比抗壞血酸固體粉末試劑要更方便定量使用。從圖上(圖1)明顯看出使用30μL β-巰基乙醇后DNA電泳條帶明顯亮于兩外兩個(gè)梯度，表明提取出的DNA質(zhì)量和濃度均高于另兩個(gè)梯度的β-巰基乙醇，因此選擇30 μL β-巰基乙醇作為抗氧化劑。再采用改進(jìn)后的方法(改良CTAB法，30μL β-巰基乙醇)對(duì)6個(gè)不同種源的臺(tái)灣榿木樣品DNA進(jìn)行提取。從瓊脂糖凝膠電泳(圖2)中可以明顯看出，提取出的臺(tái)灣榿木DNA質(zhì)量較好，條帶清晰，膠孔無(wú)殘留，幾乎無(wú)拖帶。說(shuō)明提取出的DNA樣品濃度高、雜質(zhì)相對(duì)較少，適合用于后續(xù)SSR-PCR擴(kuò)增。將臺(tái)灣榿木DNA使用高通量測(cè)序后開(kāi)發(fā)SSR引物，本研究采用基因組測(cè)序后設(shè)計(jì)的引物QR83(F：TGAACAATGCAAAAGGGTGA；R：AAATGGTCTGCTGCGTTTCT)進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證本次使用改良方法提取的DNA在PCR中擴(kuò)增效果。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，75 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(120 V，2 h)后采用銀染法顯影觀察條帶(圖3)。從聚丙烯凝膠條帶可以看到，臺(tái)灣榿木6個(gè)種源的DNA在SSR-PCR擴(kuò)增中都能擴(kuò)增出明顯條帶，且條帶清晰邊緣銳利。說(shuō)明改進(jìn)后的DNA提取方法對(duì)臺(tái)灣榿木非常適用，可高效的獲得供分子標(biāo)記使用的高質(zhì)量DNA材料。

4 討論

一種高效的DNA提取方法在分子生物學(xué)中至關(guān)重要[9]，通常植物組織富含多糖、多酚類(lèi)物質(zhì)，會(huì)降低提取到的DNA質(zhì)量從而影響后續(xù)PCR擴(kuò)增的結(jié)果[10]。CTAB可以有效去除多糖，SDS雖可有效去除蛋白質(zhì)但對(duì)多糖多酚不能有效去除[11]，本研究發(fā)現(xiàn)使用兩種方法結(jié)果差異不大。SDS法提取的DNA得率比CTAB法要低，質(zhì)量稍微欠佳，雖然可以滿足部分分子標(biāo)記的使用，若是進(jìn)行測(cè)序等試驗(yàn)還略有欠佳。在研磨過(guò)程中SDS提取液會(huì)與樣品產(chǎn)生大量泡沫，大量泡沫會(huì)導(dǎo)致無(wú)法充分的將研磨液從研缽中轉(zhuǎn)移到離心管中，CTAB提取液則無(wú)泡沫產(chǎn)生。因此無(wú)論是DNA得率和質(zhì)量，還是操作的高效性，CTAB法更適合臺(tái)灣榿木DNA的提取。楊立國(guó)[12]等在對(duì)5種(小麥、玉米、甘藍(lán)、花生、菠菜)常見(jiàn)植物DNA提取的研究中也同樣認(rèn)為CTAB法比SDS更適合植物幼葉DNA的提取。

圖2 臺(tái)灣榿木6個(gè)種源樣品DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

Marker由上往下分別為900bp、500bp、300bp、200bp、100bp

圖3引物QR82在6個(gè)臺(tái)灣榿木種源樣品中SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

植物葉片中的多糖、多酚等次生物質(zhì)會(huì)在DNA沉淀時(shí)附著在DNA上形成難溶于TE的膠狀沉淀或是發(fā)生褐變[13,14]。使用抗氧化劑可以避免植物樣品發(fā)生褐變以去除多酚類(lèi)次生物質(zhì)[15]。本研究結(jié)果表明β-巰基乙醇和抗壞血酸都可以在抗氧化上起到作用。β-巰基乙醇的用量越高DNA的得率也越高，但高濃度對(duì)抗氧化效果基本無(wú)顯著差異，但具有刺激性氣味且容易揮發(fā)。抗壞血酸低濃度時(shí)可起到抗氧化作用且不會(huì)導(dǎo)致DNA的降解，高濃度的抗壞血酸會(huì)造成DNA的降解，但具有無(wú)刺激性氣味的優(yōu)點(diǎn)。抗壞血酸是粉末狀需要精準(zhǔn)稱(chēng)量，這增加了試驗(yàn)的操作步驟，與提出高效高質(zhì)DNA的目的相悖，而β-巰基乙醇為液體吸取方便。因此對(duì)比兩種抗氧化劑后認(rèn)為β-巰基乙醇配合CTAB法更適合臺(tái)灣榿木DNA的提取。