中草藥對異育銀鯽感染嗜水氣單胞菌防治效果的研究

陳 凱 謝 駿，2 吳家玉,2 潘良坤 潘曉川

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業農村部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，江蘇 無錫 214081；2.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇 無錫 214128；3.加拿大經典中醫研究院，不列顛哥倫比亞 溫哥華 V8W 1Z3)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種常見的水生動物條件致病菌，由于近年來養殖密度、養殖環境以及藥物的不合理使用，使得以嗜水氣單胞菌為代表的水生動物細菌性病害頻發且不易防治，由此對水產養殖業造成了巨大的經濟損失。

目前，中草藥及其提取物在水產病原菌體外抑菌研究較多，何愛華等(2011)、張海賓等(2006)、肖輝等(2009)在其研究中均發現黃連等中草藥對嗜水氣單胞菌具有明顯的抑菌作用。然而，一方面由于中草藥及其提取物成分組成復雜，其作用同時涉及對病原菌的抑殺和對宿主的免疫機能調節，另一方面從宿主的角度進行藥物保護效果的評價更為簡單直接，因此學者們更多的是從對宿主的保護率以及免疫功能等方面開展相關評估研究。目前對于中草藥有效成分如多糖、苷類和生物堿等，能提高機體免疫力，增強其對病原生物的防御能力的觀點已被廣泛認同(敖禮林，2017)。但針對學者提出的“中草藥及其提取物還具有阻止、限制以及修復病原菌引起的組織損傷的能力，進而使疾病進程最小化，從而實現抵抗感染的致病作用”(趙小然，2017)，這一點在應用中草藥開展水產病害防治研究方面的關注尚顯不足。而大黃、黃連作為水產細菌性病害防治的常用中草藥，為評價大黃、黃連相關組方是否具備這種以特異性組織損傷調控為靶向的作用效果，我們以異育銀鯽人工感染嗜水氣單胞菌為模型，開展了相關研究。

一、材料與方法

實驗所用異育銀鯽均由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南泉養殖基地提供，魚體健康無傷，活力強，規格(53.6±4.5)克/尾。異育銀鯽被隨機分入相同型號的養殖桶中，持續增氧，光周期同自然光，水溫維持在(28±1)℃，每天投喂3次，投喂量為體重的2.5%。暫養適應1周后開始實驗。

實驗所使用的嗜水氣單胞菌株為本實驗室自行分離鑒定。菌株保存在-80℃甘油管中，使用前在營養瓊脂平板上劃線，28℃過夜培養，挑取單克隆接種營養肉湯培養至對數期，根據預實驗結果調整細菌濃度為2.2×106CFU/毫升，按100微升/尾的劑量進行腹腔注射。隨機將魚分為對照組、感染組、預防組、低劑量治療組和高劑量治療組，每組包含3個平行處理(即為3個養殖桶)，每個平行15尾魚。對照組實驗開始后不做攻毒處理，不使用藥物處理；感染組實驗開始后進行攻毒處理，但不使用藥物處理；預防組實驗開始時先將藥物應用到實驗魚所在養殖桶，使藥物終濃度為40微升/升，藥物處理兩小時后進行攻毒處理；低劑量治療組在實驗開始時進行攻毒處理，攻毒處理完成兩小時后應用藥物處理，使藥物終濃度為4微升/升；高劑量治療組在實驗開始時進行攻毒處理，攻毒處理完成兩小時后應用藥物處理，使藥物終濃度為40微升/升。

攻毒后24小時通過尾椎靜脈采集血液(每個平行10尾魚)，5000轉/分、5分鐘、4℃收集血漿，-20℃保存備用。同時記錄攻毒后72小時內的死亡數量(取樣魚不計入死亡數據)及臨床癥狀。使用全自動生化分析儀(邁瑞BS-400)檢測異育銀鯽血漿乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)水平，所用血液生化試劑購自上海執誠生物科技有限公司。

實驗數據用SPSS 18.0統計軟件包中的單因素方差分析，檢驗各組間的差異，不同的字母表示各組之間比較差異顯著(P＜0.05)。

二、結果

1.臨床癥狀及死亡率

對照組魚類無明顯異常，體表未出現發病癥狀，而實驗組(感染組、預防組和治療組)的發病魚都出現肛門紅腫、體表有出血和腫脹現象，解剖可見腹腔內偶有腹水、腸道內無食物，內臟有不同程度充血現象(圖1)。

圖1 感染異育銀鯽的臨床癥狀

對照組72小時存活率為100%，感染組72小時存活率為73.3%，預防組72小時存活率為77.8%，低劑量治療組A 72小時存活率為86.7%，高劑量治療組B 72小時存活率為80.0%(圖2，表1)。預防組和治療組的存活率均高于感染組，其中低劑量組的存活率最高。藥物保護效率分析結果顯示，低劑量組保護效果最佳，保護效率為50%。

圖2 不同處理方案下異育銀鯽的存活情況

表1 不同處理方案下異育銀鯽的死亡情況(n=15)

2.ALT、AST、LDH檢測結果及組織細胞損傷評價。

ALT檢測結果(圖3)顯示，感染組血漿ALT活性顯著高于對照組(P＜0.05)，而不同藥物處理方案干預后，其ALT活性與對照組無統計學差異(P＞0.05)。由此表明，嗜水氣單胞菌對異育銀鯽體內組織器官造成了損傷，而上述藥物處理方案能明顯改善這一損傷的狀態，而不同處理方案在ALT水平上未表現出明顯的差異效果(P＞0.05)。

圖3 不同處理方案下對谷丙轉氨酶的影響

血漿AST活性(圖4)在各組之間的變化并不顯著(P＞0.05)，一方面可能細菌感染并未引起組織器官的細胞出現損傷相關，另一方面也顯示出該藥物的不同應用方案可能對細胞損傷無明顯的保護作用。

圖4 不同處理方案下對谷草轉氨酶的影響

LDH檢測結果(圖5)表明，感染組血漿LDH活性與對照組相比出現了顯著升高(P＜0.05)，由此可見嗜水氣單胞菌感染造成了機體組織細胞的損傷，而這種損傷在預防和治療處理時均能得到有效的改善，其中低劑量治療處理和對相關指標改善稍差，但與其他兩種處理方案結果無顯著差異(P＞0.05)。

圖5 不同處理方案下對乳酸脫氫酶的影響

三、討論

近年來，由于細菌耐藥問題，使用抗生素防治水生動物細菌性病害的傳統手段處境艱難，中草藥在國內應用于疾病防治歷史悠久，但由于中草藥長期以來依賴于傳統中醫理論發揮其防治疾病的作用，并不能很好地被西醫理論體系所闡明，而其作為新型綠色漁藥研究的方向，應用現代西醫理論闡明其防治疾病的機理對于其推廣應用以及深入開發中草藥資源具有重要意義。目前關于中草藥治療疾病的研究主要涉及3個方面，其一是中草藥直接與病原菌作用，主要表現為抑菌、抑制毒力等方面的作用；其二是中草藥對宿主免疫系統的調節作用，進而間接作用于病原菌；其三是中草藥能對疾病進程進行干預，通過限制、修復疾病進程中的組織細胞損傷，進而實現對疾病的治療。

ALT、AST以及LDH均存在于細胞內，但是在不同細胞中的含量不同。細胞損傷時釋放到血液中，進而造成血液中相關指標升高。目前人類醫學檢測中常常將血清ALT和AST水平用來評價肝臟的健康狀態，而血清LDH水平則常常用來診斷心肌性疾病，但是魚類相關研究中尚未明確指出ALT、AST和LDH和具體組織器官之間健康狀態的關聯性。不過，血清中ALT、AST和LDH與機體細胞損傷之間的關聯是毋庸置疑的，本研究以此作為前提，開展了對大黃、黃連相關組方對宿主組織損傷調控方面的研究，結果表明大黃、黃連相關組方確實存在對宿主組織損傷的改善作用，但是從不同方案處理后的死亡情況來看，預防處理的效果不理想，可見這種作用對于藥物應用的時機把控十分重要，而關于具體應用時機的定性，仍然需要大量的基礎研究。