類葉牡丹提取物通過NF-κB信號通路影響類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞的增殖及凋亡

曾茂湘，呂兆宇，李妍

（深圳市龍崗區第二人民醫院外二科，廣東 深圳 518112）

類風濕關節炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是一種由環境因素和遺傳因素共同影響，與多種基因有關的自身免疫炎性疾病，嚴重者可出現關節畸形，致殘率非常高，嚴重影響患者的日常工作和生活［1］。在RA的病理過程中機體的免疫調節網絡失衡，促炎因子分泌增多，炎性細胞募集活化，誘發成纖維樣滑膜細胞 （fibroblast-like synoviocytes，FLS）異常增殖，表現出類腫瘤細胞樣的特性，分泌基質金屬蛋白酶 （MMPs）和炎性因子，參與炎癥反應，損傷骨及關節軟骨［2］。NF-κB信號通路介導的細胞凋亡對FLS的存活和增殖有重要的影響［3］。 類葉牡丹 （Caulophyllum robustum Maxim，CRM）臨床上常被用于跌打損傷、RA、胃痛等治療，有活血理氣的功效。本文以從RA患者關節處分離的FLS為細胞模型，研究CRM提取物 （CRME）抗RA的藥理作用及NF-κB信號通路的參與機制，為CRM的臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 選取2018年12月至2019年12月在我院骨科或者風濕病科因RA行關節清理手術的25例患者的滑膜組織，分離出FLS為RA-FLS組，其中男7例，女18例，平均年齡 （55.86±12.93）歲；另取同期因非RA行手術患者的滑膜組織，分離出FLS為空白對照，其中男10例，女15例，平均年齡 （53.71±13.07） 歲。 納入標準： （1）RA患者符合2010年美國風濕病學會聯合歐洲抗風濕病聯盟的RA分類標準； （2）對照組患者為因外傷進行關節手術的非RA患者； （3）患者對研究知情同意且簽署協議書。排除標準： （1）患者存在嚴重心腦血管或肝腎疾病； （2）腫瘤、痛風、甲亢、糖尿病、結核病及其他內分泌代謝疾病患者；（3）術前進行免疫治療的患者；（4）存在除RA外的自身免疫性疾病患者。本研究經醫院倫理委員會審查，研究對象的一般資料比較差異無統計學意義。

1.2 藥品和試劑 CRM根莖 （四川恒源醫藥有限公司）由黑龍江中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定為正品；PDTC（NF-κB信號通路抑制劑） （美國AbMole公司）；四甲基偶氮唑藍 （MTT） （上海碧云天生物技術有限公司）；白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-4（IL-4）、血管內皮生長因子（VEGF）、Bax、Bcl-2、p65的ELISA試劑盒 （美國R＆D Systems公司）；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒 （上海碧云天生物技術有限公司）；DMEM培養基 （美國Gibco公司）；胎牛血清 （美國Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素 （上海碧云天生物技術有限公司）；DMSO（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 儀器 SW-CJ-2F超凈工作臺 （上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；HEARcell 150i二氧化碳培養箱 （美國賽默飛世爾科技公司）；FV1000共聚焦顯微鏡 （日本奧林巴斯）；SpectraMax Paradigm酶標儀 （上海美谷分子儀器有限公司）；BD FACSCalibur流式細胞儀、Avanti J-E離心機 （美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 CRME的提取 取1 kg CRM根莖，加入95%乙醇浸泡24 h，回流提取2 h，重復2次，以70%乙醇和純凈水 （V／V）于AB-8大孔樹脂洗脫，將洗脫液濃縮，濃縮液靜置24 h后抽濾，將濾液于55℃進行旋蒸，收集固體粉末，稱重，得212.53 g，提取率為21.253%。

1.4.2 FLS分離、培養及鑒定 用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌無菌條件下收集的關節滑膜組織3次，去除脂肪組織后將其剪碎，以胰酶和膠原酶依次消化30 min和3 h，用DMEM培養基重懸FLS，置于5%CO237℃條件下培養，傳至2～3代進行后續實驗。原代細胞培養3代后，細胞形態呈三角形或梭形，免疫熒光染色顯示波形蛋白 （Vimentin） （＋）、 CD68 （-）。

1.4.3 MTT法檢測FLS細胞增殖活性 取正常組、RA-FLS組原代FLS于96孔細胞培養板中接種1×105個細胞／孔，培養24 h后將上清棄去。將RA-FLS組分為5組，RA-FLS組加入不完全培養基，給藥組加入含濃度為 50、100、500μg／ml CRME的不完全培養基和給予含50μmol／L PDTC的不完全培養基；正常FLS為對照，加入不完全培養基。每個組別設置5個復孔。繼續培養24 h，每孔加入5 mg／ml的 MTT溶液20μl，37℃ 5%CO2培養箱中孵育4 h，棄去上層培養液，加入二甲基亞砜 （DMSO）溶液150μl，于搖床上振蕩10 min，用酶標儀測各孔在490 nm處的吸光度值，計算抑制率。

1.4.4 ELISA法檢測細胞因子表達水平 按照ELISA試劑盒說明書檢測 IL-6、IL-4、VEGF、Bax、Bcl-2、p65的表達水平。實驗重復3次。

1.4.5 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況 用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，PBS重懸后離心，以Annexin V-FITC結合液重懸細胞，以Annexin V-FITC和碘化丙啶染色，避光室溫孵育20 min后冰浴，流式細胞儀檢測后采用CFlow Plus軟件分析。實驗重復3次。

1.5 統計學方法 采用Graphpad prism 6軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，各組的OD值、細胞因子表達水平和凋亡率的組間比較采用One-way ANOVA檢驗和 Student′st檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRME和PDTC對FLS增殖活性的影響 給藥后24 h，MTT法檢測FLS的增殖活性，RA-FLS組與正常組增殖活性比較差異有統計學意義 （P＜0.01）； RA-FLS＋PDTC 組和 RA-FLS＋不同濃度CRME （50、 100、 500 μg／ml） 組 OD 值分別與RA-FLS組比較差異均有統計學意義 （P＜0.05）。見表1。

表1 CRME和PDTC對FLS增殖活性的影響

2.2 CRME和PDTC對FLS IL-6、IL-4、VEGF、Bax、Bcl-2、p65表達的影響 和正常組比較，RA-FLS組細胞IL-6、IL-4、VEGF、Bcl-2、p65表達水平顯著升高 （P＜0.01）； 和 RA-FLS組比較， RA-FLS＋50、 100、 500 μg／ml CRME 組和 RA-FLS＋PDTC組 IL-6表達水平顯著降低 （P＜0.01）， RA-FLS＋100、 500 μg／ml CRME 組和 RA-FLS＋PDTC組IL-4表達水平顯著升高 （P＜0.05或0.01）， RA-FLS＋500 μg／ml CRME 組 VEGF表達水平降低 （P＜0.05）。 和RA-FLS組比較，RAFLS＋PDTC 和 RA-FLS＋ 50、 100、 500 μg／ml CRME組 Bax的表達水平顯著升高 （P＜0.05或0.01）， RA-FLS＋50、 100、 500 μg／ml CRME 組和RA-FLS＋PDTC組Bcl-2的表達水平差異無統計學意義 （P＞0.05）， RA-FLS＋500 μg／ml CRME 組和RA-FLS＋PDTC組p65的表達水平均顯著減低 （P＜0.01）。 見表 2、 表 3。

表2 CRME和PDTC對IL-6、 IL-4、 VEGF表達的影響 （pg／ml）

表3 CRME和PDTC對Bax、Bcl-2、p65表達的影響

2.3 CRME和PDTC對FLS細胞凋亡的影響 正常組細胞凋亡率為 （2.17±0.98）%，RA-FLS組為 （3.79±0.46）%，2組比較差異無統計學意義（P＞0.05）； RA-FLS＋50、 100、 500 μg／ml CRME組和RA-FLS＋PDTC組細胞凋亡率分別為 （5.48±1.13）%、 （8.91±0.67）%、 （11.37±1.26）%和（6.83±1.02）%， 和 RA-FLS組比較， 100、 500 μg／ml的CRME和PDTC能夠增加細胞凋亡率 （P＜0.05）。

3 討論

RA是慢性進行性的自身免疫疾病，臨床表現為四肢關節的侵襲性、對稱性、多關節的關節炎癥，病變關節出現腫脹、疼痛及功能障礙，嚴重者導致關節畸形，嚴重影響日常生活質量［4］。RA與機體的免疫功能異常有緊密關系，其病理過程有諸多細胞因子、趨化因子、生長因子、細胞內信號分子和轉錄因子參與［5］。糖皮質激素和非甾體類抗炎藥是當前治療RA的主要治療藥物，但是特效治療藥物仍然缺乏，且當前抗RA藥物的長期使用也存在較多的不良反應。CRM性溫，味苦、辛，有理氣止痛和祛風活血的功效，研究顯示其作用可能和抑制非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫有關［6］。生理情況下，FLS和巨噬細胞樣滑膜細胞組成滑膜結構的襯覆細胞層，通過分泌潤滑液和細胞外基質，參與維持關節的正常活動功能［7］。當關節出現炎癥反應時，某些細胞因子或者趨化因子可激活FLS，激活的FLS異常增殖并加重炎癥反應，形成血管翳，同時能夠侵蝕骨和軟骨，促進骨降解，參與RA的病理進程［8］。因此，抑制RA-FLS的過度增殖或促進其凋亡可能成為治療RA的有效方式。

本研究選擇CRME和NF-κB信號通路的抑制劑 （PDTC），以FLS為研究對象，觀察CRME和PDTC對RA-FLS細胞增殖和凋亡的影響及和NF-κB信號通路相關的分子機制。對PDTC和各劑量組的CRME對RA-FLS細胞增殖活性的影響進行探討，結果顯示，和正常組比較，RA-FLS組的細胞增殖活性顯著提升；和RA-FLS組比較，PDTC和各劑量組的CRME均減少了RA-FLS的異常增殖。流式細胞術檢測PDTC和CRME對RA-FLS凋亡的影響，結果顯示RA-FLS組和正常組細胞的凋亡率差異無統計學意義，PDTC和100、500 μg／ml的 CRME升高了 RA-FLS細胞的凋亡率，提示CRME可能通過抑制RA-FLS的異常過度增殖和促進RA-FLS的凋亡發揮抗RA的藥理作用。

IL-6和IL-4等細胞因子參與炎癥過程，存在于關節滑膜和血清中。IL-6可促進炎癥相關的Th17細胞的分化和B細胞的合成，參與炎癥過程［9-10］。本研究結果顯示，和正常組比較，RAFLS組的IL-6表達水平顯著升高，給予PDTC和各劑量組的CRME均能顯著降低IL-6的表達水平，提示CRME的抑制炎癥反應的作用效果，可能和抑制NF-κB信號通路有關。IL-4為Th2細胞分泌的抑制炎癥反應的細胞因子，能夠抑制Th1細胞增殖，拮抗TNF-α的炎癥效應［11］。和正常組相比，RA-FLS組的IL-4表達水平顯著升高，給予PDTC和100、500μg／ml的CRME均能顯著升高IL-4的表達水平，提示CRME可能和對Th1／Th2細胞增殖和分化的影響有關。NF-κB信號通路活化后，釋放p65并轉移入細胞核內，進而調節炎癥和凋亡相關的基因表達［12］。 Okamato等［13］研究發現RA病理過程中，NF-κB信號通路活化，抑制其活性能夠改善RA。本研究結果顯示，和正常組相比，RA-FLS組的p65表達增多，提示NF-κB信號通路活化；PDTC和500μg／ml的 CRME能夠降低p65表達，提示CRME通過抑制NF-κB信號通路活化進而發揮改善炎癥和對RA的治療作用。

研究顯示，VEGF能夠提升血管內皮細胞形成管腔的能力，誘導血管內皮細胞增生和遷移，與血管翳的形成密切相關，RA患者血清中的VEGF水平高于健康對照組［14-15］。軟骨破壞也與其表達升高有關，本研究結果顯示和正常組相比，RAFLS組細胞表達 VEGF增多；500μg／ml的 CRME能夠降低RA-FLS表達VEGF，PDTC則無此效果，RA病理過程中血管新生受到多種因素的影響，有研究顯示缺氧能夠激活血管生成的級聯反應，促進RA的發展［16］，提示CRME可能通過降低VEGF表達發揮抗RA作用。Bax是經典的促凋亡因子，Bcl-2發揮抗凋亡作用，Perlman等［17］研究顯示Bcl-2在RA患者的滑膜組織中表達升高，影響FLS的凋亡。本研究結果顯示，PDTC和各濃度的CRME均顯示出升高RA-FLS的Bax表達水平的作用，對RA-FLS的Bcl-2表達水平沒有顯著影響，說明CRME可能通過上調促凋亡因子Bax的作用機制促進RA-FLS的凋亡。

綜上所述，CRME可抑制血管新生，通過抑制NF-κB信號通路活化減輕炎癥反應，抑制FLS增殖并促進其凋亡，發揮抗RA的藥理作用。