原發性干燥綜合征患者外周血調節性B細胞表達水平及意義

孫超，王健，王信，郭文靜，李志軍

（蚌埠醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，安徽 蚌埠 233000）

干燥綜合征是一種主要侵犯機體唾液腺、淚腺、外分泌腺，且隨病情進展可累及其他器官、系統損害的自身免疫性疾病，患者主要臨床表現為口咽干燥等［1］。目前，對于干燥綜合征的發病機制尚處于研究探索階段。研究指出，體液因子、細胞因子、環境、遺傳等因素在干燥綜合征發病中起到了重要作用，是多種因素共同作用的結果［2-3］。在干燥綜合征發病過程中，部分細胞因子具有輔助機體免疫系統中細胞之間信號傳遞，趨化免疫細胞到達淚腺、唾液腺等分泌腺體，以及調節免疫功能的作用［4］。近年來研究發現，調節性B細胞 （Bregs）能夠通過分泌轉化生長因子β1（TGF-β1） 及白介素-10（IL-10） 等細胞發揮負向調控免疫的作用［5］。研究顯示，在多種自身免疫性疾病如類風濕關節炎中，Bregs表達水平均出現異常［6］。本研究通過檢測原發性干燥綜合征患者外周血Bregs細胞水平變化情況，分析了Bregs在原發性干燥綜合征發病機制中的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取蚌埠醫學院第一附屬醫院2017年1月至2019年4月收治的36例干燥綜合征患者作為病例組，入選標準： （1）均符合干燥綜合征的診斷標準［7］； （2） 均為初治者； （3） 入組前均未接受免疫抑制劑、糖皮質激素等治療；（4）均為原發性干燥綜合征；（5）研究對象及家屬均對本研究知情同意。排除標準： （1）存在精神障礙、智力障礙以及認知功能障礙者； （2）伴有惡性腫瘤或者腎功能衰竭者； （3）合并其他免疫性疾病者；（4）入組時存在急慢性感染者；（5）長期服用甲氨蝶呤、青霉胺、激素等抗風濕藥物者；（6）年齡在18歲以下者。36例患者中，男4例，女32例；年齡19～76歲，平均年齡 （50.29±7.84）歲；歐洲風濕病聯盟制定的干燥綜合征病情評估指數 （ESSDAI）：0～2分11例，3～5分22例，6～8分3例；有系統損傷24例，無系統損傷12例；抗 SSA抗體陽性20例，陰性16例；抗SSB抗體陽性10例，陰性26例。另選取同期門診健康體檢者30例作為對照組，均無急慢性感染、自身免疫性疾病或者自身免疫性疾病家族史，其中男5例，女25例；年齡20～75歲，平均年齡（50.76±7.29）歲。2組研究對象性別、年齡等比較差異均無統計學意義 （P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術檢測Bregs細胞水平 抽取研究對象清晨靜脈血2 ml，經抗凝處理后取100μl加入至流式細管中，順序編號之后送檢；于流式細管中各加入20μl的APC-CD19單抗、FITCCD24單抗、PE-CD38單抗 （均為美國 BD Biosciences公司產品），并設置同型抗體的對照組，加入20μl的APC-IgG1單抗、FITC-IgG2b單抗、PE-IgG1單抗 （均為美國BD Biosciences公司產品）；混勻之后室溫下避光保存30 min，以確保試劑與樣本能夠充分反應；然后加入紅細胞裂解液150μl，震蕩混勻，放置于冰箱中避光保存 20 min，溫度為4℃；以2 000 r／min離心10 min，棄去上清液，取白細胞沉淀用PBS液洗滌3次，然后分別于2 000 r／min離心10 min，循環離心2次，于沉淀中加入500 ml的PBS液制成單細胞懸液，濾網過濾，使用美國BD公司生產FACSCalibur流式細胞儀進行檢測。Bregs細胞水平以Bregs細胞占CD19＋B比例進行表示。

1.2.2 ELISA法檢測血清IL-10和TGF-β1水平

抽取所有研究對象清晨靜脈血5 ml，離心后取血清置于-70℃冰箱中保存待檢；采取ELISA法檢測血清IL-10和TGF-β1水平，于檢測TGF-β1之前對血清進行酸化處理，以激活血清中的TGF-β1，嚴格按照試劑盒說明進行。

1.2.3 治療方法 病例組所有患者均給予醋酸潑尼松聯合硫酸羥氯喹治療，醋酸潑尼松片 （許昌奧森制藥有限公司，國藥準字H41021232）口服，每天1次，每次5～10 mg；硫酸羥氯喹片 （上海中西制藥有限公司，國藥準字H19990264）口服，每天1次，每次0.2 g；治療4周后再次檢測外周血Bregs細胞水平和血清IL-10和TGF-β1水平。

1.3 觀察指標 比較2組研究對象外周血Bregs細胞水平及血清IL-10和TGF-β1水平，比較病例組不同臨床特征患者外周血Bregs細胞水平，比較治療前后外周血Bregs細胞水平和血清IL-10和TGF-β1水平，分析治療前外周血Bregs細胞水平與血清IL-10、TGF-β1水平的相關性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，多組計量資料采用方差分析、q檢驗，相關性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組研究對象外周血Bregs細胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 病例組外周血Bregs細胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平均顯著高于對照組 （P＜0.01）， 見表1。

表1 2組研究對象外周血Bregs細胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 （±s）

表1 2組研究對象外周血Bregs細胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 （±s）

組別 n Bregs （%） IL-10 （pg／ml） TGF-β1 （pg／ml）對照組 30 1.34±0.67 27.45±7.62 12.05±4.37病例組 36 4.69±1.83 53.89±14.43 17.86±7.49 t值 10.206 9.033 3.924 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 不同臨床特征干燥綜合征患者外周血Bregs細胞水平比較 抗SSA抗體、抗SSB抗體陽性患者外周血Bregs細胞水平均顯著高于抗SSA抗體、抗SSB抗體陰性患者 （P＜0.05）；不同年齡、性別、ESSDAI評分以及有無系統損傷患者之間外周血Bregs細胞水平比較，差異均無統計學意義 （P＞0.05）， 見表 2。

表2 不同臨床特征患者外周血Bregs細胞水平比較 （±s）

表2 不同臨床特征患者外周血Bregs細胞水平比較 （±s）

指標 n Bregs（%） 統計值 P值年齡 （歲）≥60 14 4.86±1.94 0.501 0.620＜60 22 4.53±1.92性別男4 4.89±1.89 0.349 0.729女32 4.63±1.95 ESSDAI評分 （分）0～2 11 4.12±1.79 1.134 0.273 3～5 22 4.65±1.84 6～8 3 5.26±2.06系統損傷有24 5.21±1.97 1.129 0.267無12 4.48±1.49抗SSA抗體陽性 20 5.34±1.68 2.207 0.034陰性 16 4.07±1.76抗SSB抗體陽性 10 5.48±1.79 2.256 0.030陰性 26 4.03±1.57

2.3 干燥綜合征患者治療前后外周血Bregs細胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 治療4周后，干燥綜合征患者外周血Bregs細胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平均顯著低于治療前 （P＜0.01）， 見表 3。

2.4 干燥綜合征患者治療前外周血Bregs細胞水平與血清 IL-10、TGF-β1水平的相關性Spearman相關性分析結果顯示，外周血Bregs細胞水平與血清IL-10、TGF-β1水平均呈正相關 （r分別為 0.589、 0.004，P＜0.05）。

表3 干燥綜合征患者治療前后外周血Bregs細胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 （±s）

表3 干燥綜合征患者治療前后外周血Bregs細胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 （±s）

組別 n Bregs （%） IL-10 （pg／ml） TGF-β1 （pg／ml）治療前 36 4.69±1.83 53.89±14.43 17.86±7.49治療后 36 2.79±1.26 31.09±12.38 13.46±4.58 t值 5.131 8.924 3.007 P值 0.000 0.000 0.004

3 討論

干燥綜合征是一種累及機體外分泌腺體，主要是以侵犯淚腺以及唾液腺為主的自身免疫性疾病，多見于中老年女性，對患者生活質量造成嚴重影響。干燥綜合征病理特征為唾液腺以及淚腺等外分泌腺體中IgG型漿細胞、單核細胞、淋巴細胞大量浸潤為特點，進而引起外分泌腺功能障礙，患者臨床表現為眼干、口干等，部分患者還會出現臟器與系統損傷。干燥綜合征病因及發病機制目前并未完全明確，研究認為該病的發生與多種細胞因子異常釋放相關［8］。干燥綜合征起病緩慢，在診斷時容易出現漏診誤診，臨床中該病主要以對癥治療為主，延緩病情發展，改善口干、眼干等臨床癥狀。

部分學者認為，機體中B淋巴細胞所介導的體液免疫，可以產生多種免疫復合物、多克隆免疫球蛋白以及自身抗體，造成外分泌腺破壞以及多系統損害［9］。Bregs可以通過分泌多種細胞因子，間接或者直接作用于其他免疫細胞，進而發揮抑制炎癥反應的作用。本研究中，病例組外周血Bregs水平顯著高于健康對照組，這與相關研究結果［10］一致，說明Bregs可能參與了干燥綜合征的發病過程。進一步對不同臨床特征患者外周血Bregs細胞水平分析發現，不同年齡、性別患者之間，外周血Bregs細胞水平比較差異無統計學意義；而且在不同ESSDAI評分以及有無系統損傷患者之間，外周血Bregs細胞水平比較差異亦無統計學意義，說明Bregs可能與干燥綜合征疾病活動并無密切關系。抗SSA抗體、抗SSB抗體陽性患者外周血Bregs細胞水平均顯著高于抗SSA抗體、抗SSB抗體陰性患者，說明干燥綜合征患者Bregs細胞水平異常可能與免疫功能紊亂有密切關系［11］。

研究指出，Bregs水平在干燥綜合征患者及健康人當中，具有減輕CD4＋T細胞所介導的炎癥反應的作用［12］。本研究中，治療4周之后，干燥綜合征患者外周血Bregs表達水平較治療前顯著降低。經過治療之后，Bregs相應減少，機體內的炎癥反應減輕，患者免疫調節功能改善，病情得到緩解。Bregs可以分泌抑制性細胞因子TGF-β1以及IL-10，在介導免疫耐受以及調節免疫應答當中具有重要作用。Bregs通過分泌TGF-β1可以促進效應T細胞凋亡，減少與炎癥相關的CD8＋T細胞的數量，減少效應性T細胞上T細胞抗原受體的表達數量，削弱輔助T細胞的活化，抑制自身免疫性疾病的進展。IL-10能夠有效地抑制炎癥因子釋放及T細胞增殖，對于調節性T細胞分化或者維持起到重要作用［13］。本研究中，外周血 Bregs表達水平與血清IL-10、TGF-β1水平均呈顯著正相關性，說明Bregs可能通過分泌TGF-β1及IL-10影響機體其他免疫細胞，即發揮負向調節作用，從而維持自身免疫耐受。

綜上所述，干燥綜合征患者外周血Bregs表達水平顯著升高，可能與干燥綜合征的發病有一定關系，且患者Bregs表達水平異常可能與自身免疫功能紊亂有關，但Bregs表達水平與干燥綜合征的疾病活動無直接相關性。