高效液相色譜法測定體外透皮樣品中氧化苦參堿的含量

高白冰，李葉，趙穎，劉曉暢

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2015級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，遼寧 沈陽 110034；2.陜西省人民醫(yī)院藥學(xué)部；3.沈陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院沈陽醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心）

苦參堿類生物堿廣泛存在于苦參、苦豆子、廣豆根等豆種植物中，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)近似的生物堿，包括苦參堿、氧苦參堿、槐果堿、槐定堿等多種單體。其中，氧化苦參堿可以穩(wěn)定紅細(xì)胞和溶酶體，減少炎癥介質(zhì)的釋放，具有抗炎、抗過敏的作用，對各型濕疹均有較好的療效，對急性濕疹、亞急性濕疹、接觸性皮炎等皮膚炎癥病變的療效尤為明顯，其各類制劑已廣泛應(yīng)用于臨床［1-3］。

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)具有諸多優(yōu)點，如避免首過效應(yīng)、毒副作用少和患者依從性好等，既可通過血液循環(huán)起到全身治療作用，又可制成軟膏等局部制劑直接涂于患處直接發(fā)揮療效［4］。因此，氧化苦參堿十分適合制成外用經(jīng)皮給藥制劑。但是，區(qū)別于其他給藥途徑的是，體外透皮實驗是經(jīng)皮給藥制劑處方篩選常用的方法之一，該實驗必須使用離體皮膚這一生物樣品進(jìn)行，為接收液中藥物的定量帶來了難度［5］。因此，本研究擬開發(fā)一種高效液相色譜法 （high performance liquid chromatography，HPLC），用于測定透皮樣品中氧化苦參堿的含量，為氧化苦參堿透皮制劑處方篩選提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠6只，體重180～220 g，6～8周齡，購買于遼寧長生生物有限公司，實驗動物許可證號 SCXK（遼）2015-0001。

1.2 藥品與試劑 氧化苦參堿對照品 （批號：110780-201508）購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，純度 （98%，HPLC）。氧化苦參堿原料購于南京世洲生物科技有限公司，純度 （92.5%，HPLC）。乙腈 （上海阿拉丁試劑有限公司）、甲醇（山東禹王集團(tuán)）、三乙胺 （上海麥克林生化科技有限公司）均為色譜純，磷酸 （西隴化工股份有限公司）為優(yōu)級純，烏拉坦 （上海阿拉丁試劑有限公司）。

1.3 儀器 高效液相色譜儀 （包含自動進(jìn)樣器L-2200，高壓泵 L-2130和紫外檢測器 L-2420）（日立 （中國）有限公司）、多功能透皮擴散儀SYT-102（延吉艾迪扼科技有限公司）、臺式離心機Legend Micro17（美國賽默飛世爾科技公司）、全新智能純水／超純水一體化系統(tǒng) （美國PALL公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Spherisorb ODS2 C18色譜柱（4.6 mm×200 mm， 5μm）， 流動相為乙腈-0.3%磷酸水溶液 （10∶90，V∶V），并用三乙胺調(diào)節(jié)pH至3.1。流速1.0 ml／min，檢測波長為207 nm，柱溫60℃，進(jìn)樣量20μl。在上述色譜條件下，氧化苦參堿的理論塔板數(shù)不少于2 000，分離度為1.2。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定氧化苦參堿對照品20.0 mg，置于100 ml容量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，得濃度為200μg／ml的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液2.5 ml，置于50 ml容量瓶并用純水定容至刻度，得濃度為10μg／ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取Wistar大鼠，使用20%烏拉坦腹腔注射 （5.0 ml／kg）麻醉，將腹部毛發(fā)小心剔除，用眼科剪刀去除皮下組織得大鼠離體皮膚，備用。將約1 cm2大鼠離體皮膚在pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中浸泡12 h，浸泡液于13 000 r／min 4℃低溫離心5 min，取上清液作為空白透皮液。在空白透皮液中加入10μg／ml原料藥溶液，渦旋混勻即得模擬的供試品溶液［6］。上述動物實驗均已獲得沈陽醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

2.3 專屬性 將空白透皮液、對照品溶液和供試品溶液，分別使用2.1項下色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖1。由色譜圖可知，在該色譜條件下大鼠離體皮膚溶出物對氧化苦參堿的測定無干擾。

圖1 氧化苦參堿的HPLC圖

2.4 定量限與檢測限 取氧化苦參堿對照品溶液適量，用蒸餾水逐步稀釋，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，氧化苦參堿的定量限為3 ng（信噪比S／N＝10），檢測限為1 ng（信噪比S／N＝3）。

2.5 線性與范圍 取200μg／ml氧化苦參堿對照品儲備液2、2.5、0.5、0.5、0.1、0.5 ml分別置于10、 25、 10、 25、 10、 100 ml容量瓶中， 用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，制成濃度為40、20、10、4、2、1μg／ml的氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。 進(jìn)樣20μl， 將藥物濃度 X （μg／ml） 與峰面積 Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝29 985.0X-2 174.8，相關(guān)系數(shù) （R2）＝0.999 9。結(jié)果表明，氧化苦參堿在1.055～42.2μg／ml范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 精密吸取氧化苦參堿對照品溶液20μl，在上述色譜條件下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測定氧化苦參堿的峰面積。結(jié)果表明，氧化苦參堿峰面積為314 172±3 613，RSD為1.15%，表明儀器的精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取6只Wistar大鼠按 “2.2.2供試品溶液的制備”項下制備6份供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測定，計算含量。結(jié)果表明，供試品溶液中氧化苦參堿的含量平均值為5.14 μg／ml，RSD為1.97%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取氧化苦參堿原料藥0.0151 g，置于1 000 ml容量瓶中，以空白透皮液為溶劑定容至刻度，搖勻。然后將該溶液于32℃恒溫水浴下分別放置0、2、4、8、12、24 h后，按上述色譜條件測定，氧化苦參堿峰面積為450 593±11 535，RSD為2.56%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗 以空白透皮液為溶劑，配制1、20、40μg／ml的低、中、高三個濃度的氧化苦參堿溶液各3份，于13 000 r／min 4℃低溫離心5 min后進(jìn)樣，將測得的藥物峰面積帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得藥物濃度與理論濃度的比值得到回收率。低、中、高3種濃度的平均回收率依次為（99.7±0.6）%、 （100.2±0.5）%、 （100.6±0.4）%，均在98%～102%之間，回收率良好。

2.10 樣品含量測定 分別使用椰子油和霍霍巴油為油相，使用機械攪拌乳化法制備兩種水包油型氧化苦參堿軟膏，分別取氧化苦參堿軟膏500 mg于立式擴散池的供給池中，接收池中加入4 ml pH為7.4的磷酸鹽緩沖液作為接收液，在32℃恒溫下每2 h取樣2 ml，并補加新鮮的磷酸鹽緩沖液2 ml，共計透皮 8 h。獲得的體外透皮樣品按2.2.2項下對樣品進(jìn)行處理，并按2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，以外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見圖2，處方一和處方二的8 h累積透過量分別為 （19.97±3.58） μg／cm2和 （7.62±2.37） μg／cm2。 結(jié)果表明，該HPLC法可用于透皮制劑的處方篩選。

3 討論

3.1 波長的選擇 取氧化苦參堿對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，在200～600 nm范圍內(nèi)氧化苦參堿在207 nm處有最大吸收峰，因此選擇207 nm作為測定波長。

3.2 色譜條件的選擇 本研究對流動相系統(tǒng) （乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)）進(jìn)行考察。結(jié)果乙腈-水系統(tǒng)在低波長207 nm下可以獲得滿意的色譜峰峰形。此外，柱溫對于氧化苦參堿的分離效果具有較大的影響。在該流動相條件下，25、35、40、50℃時，氧化苦參堿色譜峰峰形差，且不能與雜質(zhì)峰分離；柱溫為60℃時分離效果好，出峰時間快。因此，最終選擇乙腈-0.3%磷酸水溶液（10∶90，V∶V），柱溫60℃為色譜條件。

圖2 使用HPLC法測定的不同透皮制劑中氧化苦參堿的累積透過量

綜上所述，本研究所建立的HPLC方法操作簡單，線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率良好，能準(zhǔn)確測定體外透皮樣品中氧化苦參堿的含量，可作為氧化苦參堿處方篩選的檢測方法。