中性粒細胞胞外誘捕網通過活化角質形成細胞黑素瘤缺乏因子2炎癥小體參與銀屑病發生發展

袁旭 邵帥 王剛

第四軍醫大學西京皮膚醫院，西安710032

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，其重要病理特征之一是表皮處中性粒細胞聚集形成微膿瘍［1］。隨著研究的深入，中性粒細胞的功能越來越受到人們關注。中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NET）由中性粒細胞釋放，骨架結構為直徑15 ～17 nm的染色質纖維［2］，主要由DNA 和瓜氨酸化的組蛋白（citrullinated histone 3，Cit-H3）構成，其上附有中性粒細胞顆粒中的各種蛋白酶、抗菌肽等［3］。NET的形成過程是一種區別于凋亡及壞死等新的細胞死亡方式［4］。病原微生物組成成分如脂多糖等與人體中的免疫復合物及細胞因子能激活中性粒細胞內活性氧系統（reactive oxygen species，ROS），引發髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒細胞彈力蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和肽基精氨酸脫亞酶Ⅳ（peptidyl arginine deiminaseⅣ，PAD4）的核轉位，終致核酸的解聚和釋放，產生NET 網狀結構［5］。NET不僅在機體抵御病原微生物入侵中發揮重要作用，且能夠參與多種自身免疫性疾病發病和進展［4，6］。在系統性紅斑狼瘡中，NET相關分子能夠激活巨噬細胞的炎癥小體Nod樣受體蛋白3（NLRP3）或黑素瘤缺乏因子2（AIM2），導致白細胞介素（IL）1β 和IL-18 的產生及釋放，而IL-1β 和IL-18 又能促使NET 形成，形成正反饋環路促進炎癥進展［7-8］。AIM2 炎癥小體是雙鏈脫氧核糖核苷酸（doublestranded deoxyribonucleic acid，dsDNA）的受體之一，能夠識別外來病原體或自身受損細胞所暴露的DNA，通過活化前體胱天蛋白酶1（caspase-1）介導下游炎癥因子如IL-1β的產生及釋放參與免疫防御或誘導細胞凋亡［9］。本文探討以自身DNA和組蛋白作為骨架結構的NET對角質形成細胞AIM2炎癥小體的活化作用及其對銀屑病免疫微環境紊亂的影響。

材料與方法

一、標本收集

篩選2018 年1-12 月于第四軍醫大學西京皮膚醫院就診的進展期尋常型銀屑病患者，無其他系統性疾病，收集4例患者皮損標本4份，另外4例患者外周血標本4 份。于本院燒傷與整形外科收集健康對照皮膚組織標本4份，于泌尿外科收集15歲以下兒童包皮環切術后的包皮標本3 份。本研究通過第四軍醫大學西京醫院醫學倫理委員會批準（批準號：KY20163202-1），所有受試者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

紅細胞裂解液（美國Thermal Fisher 公司）、CD15 人中性粒細胞分選磁珠抗體（美國Miltenyi biotec 公司）、磁珠陽性分選磁柱（美國Miltenyi biotec公司）、佛波酯（PMA，美國Sigma公司）、IL-1β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）、中性蛋白酶Ⅱ（dispaseⅡ，美國sigma公司）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ，美國Thermal Fisher 公司）、即用型正常山羊血清（壯志生物科技有限公司）、中效細胞裂解液（RIPA）、SDS-PAGE凝膠試劑盒。RPMI 1640、Keratinocyte-SFM 培養基（美國Gibco 公司），DAPI、Hoechest 核染料（碧云天生物技術有限公司）。Western 印記試驗一抗：AIM2 兔抗（美國Cell Signaling Technology 公司）、IL-1β鼠抗（美國Abcam公司）；二抗：辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠/兔IgG抗體（康為世紀生物科技有限公司）。免疫熒光試驗一抗：AIM2 兔抗、MPO 兔抗、NE 兔抗、IL-1β 鼠抗、Cit-H3 鼠抗（英國Abcam 公司）；二抗：CY3/FITC 標記的山羊抗小鼠/兔IgG熒光二抗（康為世紀生物科技有限公司）。

三、方法

1.免疫熒光檢測Cit-H3、MPO、NE、AIM2 在銀屑病皮損及健康對照皮膚中的表達：取銀屑病患者皮損及健康對照皮膚標本組織石蠟切片，經脫蠟、高壓抗原修復、即用型正常山羊血清封閉后分別加入以下一抗組合：Cit-H3 抗體和MPO 抗體、Cit-H3抗體和NE抗體或AIM2抗體，于濕盒中4 ℃孵育過夜、洗滌，滴加相應的山羊抗小鼠/兔IgG熒光二抗，室溫避光孵育1 ～2 h 后洗滌切片，滴加DAPI 或Hoechst 核染料對細胞核染色，洗滌切片，樹脂封片，避光保存至上機檢測。

2.分離銀屑病患者外周血中性粒細胞：收取銀屑病患者外周血4 份（16 ml/份），使用紅細胞裂解液裂解紅細胞，于300×g 離心10 min，棄上清液，重復2 次；隨后用150 μl 磁珠分選液重懸細胞，加入50 μl CD15磁珠抗體混勻，于4 ℃避光孵育15 ～20 min，隨后加入5 ml 磁珠分選液洗滌懸液，于300×g 離心10 min，棄上清液，用500 μl 磁珠分選液重懸細胞，加入陽性分選的磁柱中，收集CD15陽性細胞，即中性粒細胞。

3.提取中性粒細胞NET：將獲得的中性粒細胞用無血清RPMI-1640 培養基沖懸，按2 × 106個/孔種于A、B 兩塊12 孔板中，均予50 nmol/L PMA 刺激，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育4 h。吹打并收取A 板中所有懸液，400×g 離心10 min，收集上清液于1.5 ml 離心管中，隨后18 000×g離心15 min，棄上清液，加入1 ml PBS輕柔洗滌沉淀，18 000×g再次離心15 min，沉淀即為NET［10］。B 板各孔在PMA 刺激4 h 后，另加入DNaseⅠ（2 U/ml）于37 ℃處理20 min降解NET結構，其余步驟同A板。采用分光光度計定量dsDNA 濃度，A 板127 ng/μl，B 板0.06 ng/μl。

4.人原代角質形成細胞分離培養：取新鮮包皮組織（離體時間＜2 h），沖洗后于75%乙醇浸泡消毒45 s，取出包皮組織，用含雙抗的RPMI-1640 培養基沖洗3 遍，減去皮下組織，并將包皮修剪為1.5 cm×1 cm大小的組織塊，浸泡于0.25%dispaseⅡ溶液，4 ℃消化過夜。過夜后使用眼科鑷分離真表皮，盡量剪碎表皮并用胰蛋白酶于37 ℃消化7 ～10 min，之后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基終止消化，吹打分離細胞后用無菌濾網過濾并收集濾液，于250 × g 離心5 min，用含10%胎牛血清培養基洗滌1次，于250×g離心5 min，棄上清液得到原代角質形成細胞，使用Keratinocyte-SFM 完全培養基重懸細胞并種于小瓶中，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度孵箱中培養。

5.NET處理細胞：將原代角質形成細胞傳代培養至第3代，分為4組，各以3×105個/孔接種至6孔板中，細胞完全貼壁后換液，分別加入PBS（對照組）、NET 提取物（NET 組）、經DNase I 處理的NET提取物（NET 降解組）、DNase I（降解劑對照組）刺激細胞48 h，實驗重復3次。

6.Western印記檢測NET處理后角質形成細胞AIM2 炎癥小體及其下游分子的表達：在4 組細胞中加入適量含苯甲基磺酰氟（PMSF）的中效RIPA，冰上靜置20 min，刮取并轉移各組細胞裂解液于對應的離心管中，于4 ℃以14 000×g離心15 min，棄沉淀，保留蛋白溶液（BCA 法定量）。以15 μg 上樣量電泳，經轉膜、封閉后加入相應一抗，于4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫孵育2 h，洗滌后使用ECL 化學發光顯影，目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/微管蛋白條帶灰度值。實驗重復3次。

7.ELISA 檢測IL-1β 水平：收集對照組與NET組細胞培養上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作，酶標儀測定各樣本在450 nm波長處的吸光度，根據標準曲線及各樣本對應的吸光度值計算IL-1β濃度。

8.統計學方法：采用GraphPad Prism 7軟件，計量資料以±s 表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、銀屑病患者皮損處NET 標記物與AIM2 炎癥小體的表達情況

免疫熒光結果顯示，銀屑病皮損表皮處可見Cit-H3（綠色）和MPO（紅色）呈絲網狀共染，或Cit-H3（綠色）和NE（紅色）共染（圖1），健康對照皮膚組織中未檢測到Cit-H3、MPO和NE熒光信號。

圖1 銀屑病皮損表皮中性粒細胞胞外誘捕網結構免疫熒光染色 1A：皮損表皮處可見瓜氨酸化的組蛋白（Cit-H3，綠色）和髓過氧化物酶（MPO，紅色）呈絲網狀共染，健康對照皮膚無此熒光信號；1B：皮損表皮處可見Cit-H3（綠色）和中性粒細胞彈力蛋白酶（NE，紅色）共染，健康對照皮膚無此熒光信號

健康對照皮膚組織中AIM2炎癥小體未見明顯表達，而銀屑病患者表皮處AIM2 蛋白熒光信號明顯，且主要位于微膿瘍毗鄰表皮處。見圖2。

二、NET 處理角質形成細胞對AIM2 炎癥小體表達的影響

Western印記結果顯示，不同處理組細胞AIM2蛋白及下游分子IL-1β前體及IL-1β的蛋白表達水平差異均有統計學意義（F=23.80、5.82、15.64，P ＜0.001），且NET 組均高于對照組（t = 15.14、4.256、8.710，均P ＜0.05），NET 降解組、降解劑對照組與對照組間差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。見表1、圖3。

三、NET 處理對角質形成細胞IL-1β 表達的影響

NET組角質形成細胞培養上清液中的IL-1β分泌水平（13.15 ± 3.77）pg/ml 高于對照組（3.61 ±0.20）pg/ml，差異有統計學意義（t = 2.53，P =0.024）。

討 論

銀屑病的發生發展涉及固有免疫及適應性免疫的共同激活，中性粒細胞作為固有免疫系統的重要組成部分，疾病的早期即被趨化并聚集在銀屑病皮損表皮處，是銀屑病皮損的重要病理特征，但其在銀屑病發生發展中的作用仍有待進一步探索。多項研究證實，NET可以通過激活免疫細胞等參與多種自身免疫性炎癥進展［11-13］。我們和其他團隊的前期研究曾發現，銀屑病患者皮損處存在NET，且可加重病情［14］；在動物模型中，使用PAD4 抑制劑抑制NET 形成，或用DNase I 清除NET 結構均可顯著減輕咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣表現和炎癥反應［15］。然而，NET參與銀屑病發生發展的具體機制還需進一步探索。

圖2 銀屑病皮損表皮黑素瘤缺乏因子2炎癥小體免疫熒光染色 皮損表皮處炎癥小體熒光信號明顯，且主要位于微膿瘍毗鄰表皮處（白色箭頭），健康對照皮膚中基本無此信號

表1 NET處理對角質形成細胞AIM2炎癥小體相關蛋白表達的影響（±s）

表1 NET處理對角質形成細胞AIM2炎癥小體相關蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。NET：中性粒細胞胞外誘捕網；AIM2：黑素瘤缺乏因子2 炎癥小體；IL-1β：白細胞介素1β。與對照組相比，a P ＜0.05；b P ＞0.05

組別對照組NET組NET降解組降解劑對照組F值P值AIM2 1 1.42±0.03a 1.15±0.07b 0.90±0.05b 23.80＜0.001 IL-1β前體1 1.32±0.08a 0.93±0.03b 1.03±0.12b 5.82＜0.001 IL-1β 1 1.40±0.05a 1.07±0.05b 0.96±0.07b 15.64＜0.001

圖3 Western 印記檢測中性粒細胞胞外誘捕網（NET）處理角質形成細胞后皮黑素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥小體及IL-1β前體、IL-1β 的表達 NET 組的相對表達水平均高于對照組，NET 降解組、降解劑對照組與對照組間無明顯差異

本研究發現，銀屑病患者表皮中浸潤的中性粒細胞中有NET結構形成，且皮損微膿瘍毗鄰的角質形成細胞中可顯著表達AIM2炎癥小體。體外研究結果證實，NET刺激角質形成細胞后，后者AIM2炎癥小體表達水平顯著升高，提示NET可促進角質形成細胞中AIM2 的表達。我們進一步檢測了AIM2的經典下游細胞因子IL-1β的表達，發現NET刺激組角質形成細胞后可使IL-1β前體和成熟IL-1β的分泌水平明顯升高。在銀屑病中，IL-1β 是重要的致病促炎因子之一，它能促進角質形成細胞分泌趨化因子如CCL20，趨化γδT 細胞亞群至皮損局部，同時還能激活γδT細胞促使其分泌IL-17A，加劇炎癥進程［16］。而采用DNase I 降解NET 結構后，未發現其對角質形成細胞AIM2 和IL-1β 的表達產生促進的影響。以上結果提示，本研究中從銀屑病患者外周血中提取的NET 能激活角質形成細胞中炎癥小體通路，促進IL-1β的成熟及釋放，最終參與銀屑病免疫微環境的紊亂。我們在預實驗中發現，正常人外周血中性粒細胞提取的NET 有相似的致病效應，這可能是因為無論中性粒細胞來源如何，體外誘導的NET本身即為病理結構，故而能刺激角質形成細胞。

綜上所述，本研究采用免疫熒光檢測到銀屑病患者皮損存在顯著高于健康對照皮膚的NET、AIM2。體外研究提示，NET 可促進角質形成細胞的炎癥小體通路，加重銀屑病皮損局部的免疫紊亂。二者聯系的建立，為固有免疫細胞在銀屑病發病中的作用提供了新的探究思路，也為靶向NETAIM2及下游炎癥因子的特異性治療提供了初步理論支持。但NET 通過何種機制活化角質形成細胞的炎癥小體及其下游炎癥因子，還需進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突