飽和突變改善米曲霉11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性

劉 艷， 張 婷， 闞婷婷， 李劍芳， 鄔敏辰

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫 214122）

木聚糖 （xylan）是半纖維素的重要組成成分，是一種重要的可再生生物資源[1]。內切β-1，4-木聚糖酶簡稱為木聚糖酶（xylanases，EC 3.2.1.8），能夠水解木聚糖分子主鏈內部的β-1，4-糖苷鍵，廣泛應用于食品、造紙和飼料等領域[2]。

迄今為止，已有多種不同來源的木聚糖酶基因在大腸桿菌 （Escherichia coli）、畢赤酵母（Pichia pastoris）和乳酸克魯維酵母 （Kluyveromyces lactis）等宿主菌中實現了異源表達[3-5]。不同來源的木聚糖酶酶學性質各有不同，研究發現天然存在的木聚糖酶極少可以兼具高活性和高耐熱性。因此，越來越多的研究者對木聚糖酶進行分子改造以期獲得酶學性質優良的工業化木聚糖酶[6-8]。目前對于木聚糖酶的分子改造研究主要集中在對酶的耐熱性改造方面[9-11]。然而，大多數改造后的木聚糖酶在耐熱性提高的同時伴隨著活性的下降，這在一定程度上限制了耐熱木聚糖酶在工業中的應用[12-14]。因此，一些研究者開始以耐熱性較高的天然木聚糖酶為出發菌株，通過基因突變來提高其酶活性，以期獲得耐熱性和活性俱佳的突變木聚糖酶[15-16]。羅建杰等[17]利用PCR方法將木聚糖酶XYN-W的C端57個氨基酸序列去除，比活性提高了43.9%。王謙等[18]對木聚糖酶ATX活性位點附近的單一氨基酸實施定點突變（L49P）來增強木聚糖酶的活性，Kcat/Km值較原酶提高了51.7%。雖然很多研究者通過基因突變技術對木聚糖酶進行了分子改造并取得了一定的成果，但仍未能達到工業化應用的水平，改善木聚糖酶催化特性的分子改造研究還有待進行。

作者所在實驗室從米曲霉基因組中克隆了一個木聚糖酶基因Aoxyn11A，并通過N端替換提高了該酶的熱穩定性，突變酶AEx11A的最適溫度高達75℃，比原酶高25℃，70℃的半衰期t1/270由原酶的1 min提高為197 min，但比活性下降為原酶的63%，一定程度上限制了木聚糖酶AEx11A在工業中的應用。為改善木聚糖酶AEx11A的催化特性，本研究基于生物信息學分析結果，擬對AEx11A中編碼 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和 Ile132的密碼子實施飽和突變，構建飽和突變文庫，并從中獲得表達酶活性最高的突變子。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

表達宿主E.coliBL21（DE3）：購自Invitrogen公司；重組質粒pET-28a-AEx11A：作者所在實驗室構建和保存。

1.2 主要試劑和培養基

rTaqDNA聚合酶、高保真PrimeSTAR、DNA和蛋白質Marker：購自TaKaRa公司；酵母提取物、胰蛋白胨：購自Sangon公司；考馬斯亮藍G-250、樺木木聚糖：購自Sigma公司；其它試劑均為國產或進口分析純。

LB液體培養基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，121℃高溫滅菌20 min；LB固體培養基：加入瓊脂18 g/L到LB液體培養基中，121℃高溫滅菌20 min；LB抗性培養基：添加終質量濃度達100 μg/mL的卡那霉素。

1.3 木聚糖酶的同源建模及分子對接

選擇與木聚糖酶AEx11A一級結構同源性較高，來源于E.coli的木聚糖酶晶體結構（PDB：2VGD） 為 模 板 ， 運 用 SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進行三維結構模擬。使用ChemDraw 3D Ultra 12.0構建XYN （木二糖）的三維結構并進行能量最小化。以AEx11A的三維結構為受體， 運用 AutoDock 4.2（http：//autodock.scripps.edu）程序，將底物XYN對接至酶活性中心的合適位置。采用PyMOL （http：//pymol.org/）分析對接后AEx11A的三維結構。

1.4 引物設計

基于AEx11A一級結構和三維結構分析，擬在AEx11A 的 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和 Ile132位點進行飽和突變。依據AEx11A核苷酸序列及目的突變位點設計PCR引物，由Sangon上海公司合成，見表1。

表1 飽和突變的引物Table 1 PCR primers for the saturation mutation

1.5 突變文庫的構建和篩選

以pET-28a-AEx11A為模板，T98X-F、N100XF、V124X-F、P129X-F 和 I132X-F 為上游引物，T7-R為下游引物，采用全質粒PCR（whole-plasmid PCR） 對 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和 Ile132密碼子實施飽和突變，將PCR產物用DpnⅠ消化，轉化E.coliBL21（DE3），構建飽和突變文庫。每個突變點從平板上挑選97個轉化子 （E.coli/AEx11AT98X、E.coli/AEx11AN100X、E.coli/AEx11AV124X、E.coli/AEx11AP129X和E.coli/AEx11AI132X，X代表任意氨基酸），接種于1 mL LB抗性培養基中，37℃、220 r/min培養12 h，以2%接種體積分數轉接至1 mL相同的培養基，培養至OD600約為0.6～0.8時，加入0.5 mmol/L IPTG、28℃誘導表達5 h，4℃、8 000 r/min離心5 min收集菌體，加入 200 μL、1 mg/mL溶菌酶溶液后，反復凍融破碎細胞，離心后收集上清液即為粗酶液。將酶液適當稀釋后取5 μL加入95 μL 0.5 g/dL樺木木聚糖溶液（pH 5.5、50 mmol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液）中，借助PCR儀進行催化和顯色反應（75 ℃ 10 min，加 50 μL DNS 試劑，95 ℃ 5 min，冷卻至10℃），加入96孔板中，用酶標儀測定OD540值。酶活性大于原酶30%的突變木聚糖酶所對應的突變子定義為正突變子，對其進行DNA測序。對其中酶活性提高較明顯的位點進行迭代飽和突變，DNS法篩選最優突變子。

1.6 木聚糖酶的表達和純化

將原酶和篩選得到的突變酶分別接種于含100 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培養基中進行誘導表達，收集菌體。加入適當破碎液（pH 5.5、50 mmol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液）重懸菌體，冰浴條件下，超聲波破碎細胞，4℃、12 000 r/min離心收集上清液，并經0.22 μm濾膜過濾后，取上清液加樣至Ni-NTA親和層析柱（北京Tiandz公司），以純化目的酶蛋白。

1.7 木聚糖酶的活性測定及蛋白質分析

采用DNS法[19]測定木聚糖酶活性，通過SDSPAGE分析重組表達產物；Bradford法[20]測定蛋白質質量濃度。

1.8 木聚糖酶酶學性質測定

1.8.1 最適反應溫度及溫度穩定性 將適當稀釋的酶液于60～85℃下反應，每隔5℃測定酶活性，以最高者為100%，作溫度-相對酶活性曲線。將酶液于最適溫度保溫不同時間，每隔一段時間測定殘余酶活，以未經保溫處理酶液的酶活性定義為100%，作時間-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到80%以上即定義為穩定。反應所使用的緩沖液為pH 5.5、50 mmol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液。

1.8.2 最適pH及pH穩定性 將適當稀釋的酶液在pH 3.5～7.5下于最適溫度反應，每隔0.5個pH測定酶活性，以最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線。將酶液在不同pH值下于最適溫度保溫1 h，測定殘余酶活，以最高者為100%，作pH-相對酶活性曲線。當殘余酶活達到80%以上即定義為穩定。反應所使用的緩沖液為50 mmol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液（pH 3.0～8.0）。

1.8.3 動力學參數的測定 以不同質量濃度 （1.0～10.0 mg/mL）的木聚糖溶液（pH 5.5）為底物，在木聚糖酶最適條件下測定酶活性，采用Origin 8.0軟件進行非線性擬合，計算酶的kcat及kcat/Km值。

2 結果與討論

2.1 突變位點的選定

通過搜索蛋白質PDB數據庫，獲得與木聚糖酶AEx11A的蛋白質序列一致性為76%的木聚糖酶晶體結構 （PDB：2VGD），以 2VGD為模板，利用SWISS-MODEL對木聚糖酶AEx11A進行三維結構模擬，對模擬后的AEx11A進行分子對接。對接結果見圖1。催化中心Glu89和Glu180位于底物結合口袋處。通過對AEx11A的三維結構進行保守性分析和氨基酸位置及理化性質分析，篩選出5個待突變的位點，分別為 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和 Ile132。

2.2 突變文庫的構建和最優突變子篩選

按照1.5的方法，構建飽和突變文庫，DNS法篩選酶活性提高的突變子。結果顯示，從E.coli/AEx11AT98X突變文庫中篩選出6個酶活性大于原酶30%的轉化子，選出酶活性最好的3個轉化子測序，DNA測序結果表明，這3個轉化子均表達出AEx11AT98D。從E.coli/AEx11AV124X突變文庫中篩選出4個酶活性大于原酶30%的轉化子，選出酶活性最好的3個轉化子測序，DNA測序結果表明，這3個轉化子均表達出AEx11AV124T。 而E.coli/AEx11AP129X、E.coli/AEx11AI131X和E.coli/AEx11AI132X突變文庫中沒有篩選出酶活性提高30%的轉化子。以pET-28a-AEx11AT98D為模板，在Val124位點實施迭代飽和突變，篩選得到最優轉化子E.coli/AEx11AT98D-V124Q。

圖1 AEx11A的三維結構及突變位點Fig.1 Three-dimensional structure of AEx11A

2.3 木聚糖酶的表達和純化

重 組 菌E.coli/AEx11A、E.coli/AEx11AT98D、E.coli/AEx11AV124T和E.coli/AEx11AT98D-V124Q及對照E.coli/pET-28a經IPTG誘導表達和超聲波破碎后，測定上清液的酶活性。結果表明，重組AEx11AT98D、AEx11AV124T、AEx11AT98D-V124Q的粗酶液酶活性依次為77.95、58.86、97.13 U/mL，分別是 AEx11A（30.90 U/mL）2.52、1.90、3.14倍。將上清液采用Ni-NTA柱純化，AEx11AT98D、AEx11AV124T和 AEx11AT98D-V124Q對木聚糖的比活性依次為 1 451.6、1 120.5、1 859.4 U/mg，分別為 AEx11A （612.3 U/mg） 的 2.37、1.83、3.04 倍。SDS-PAGE分析顯示，純化后的AEx11A、AEx11AT98D、AEx11AV124T和 AEx11AT98D-V124Q均約在相對分子質量26 200處呈現單一條帶，見圖2。

圖2 表達產物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed products

2.4 酶學性質分析

2.4.1 溫度對木聚糖酶活性的影響 采用DNS法測定不同溫度下（60～85℃）的酶活性，結果見圖3。AEx11A與各突變酶的最適溫度均為75℃，AEx11A在 75℃的半衰期t1/275為 174 min，與AEx11AT98D（179 min） 和AEx11AT98D-V124Q（188 min）相差不大， 而 AEx11AV124T的t1/275為270 min，是AEx11A的1.55倍，熱穩定性稍高于AEx11A。

2.4.2 pH對木聚糖酶活性的影響 采用DNS法測定酶液在不同pH值下的酶活性，結果見圖4。AEx11A與各突變酶的最適pH均為6.0，pH穩定性基本無差異。AEx11A和AEx11AV124T在pH 5.0～7.5之間保持穩定，AEx11AT98D在pH 5.0～6.5之間保持穩定，AEx11AT98D-V124Q在pH 5.0～7.0之間保持穩定。

圖3 木聚糖酶的最適溫度及溫度穩定性Fig.3 Temperature optimum and thermostability of xylanase

2.4.3 動力學參數測定 AEx11A、AEx11AT98D、AEx11AV124T和AEx11AT98D-V124Q的動力學參數見表2。突變酶的Km值與原酶相比均有所下降，對底物的親和力增強。催化效率kcat/Km值存在明顯的不同，AEx11AT98D、AEx11AV124T和 AEx11AT98D-V124Q的kcat/Km值分別為AEx11A的2.02、1.49和2.74倍。表3列出了一些GH11家族木聚糖酶的動力學參數，最優突變子AEx11AT98D-V124Q的Km值與其它GH11家族木聚糖酶相比較低，且催化效率kcat/Km值處于較高水平，這可能是由于有效的突變使得酶與底物的親和力增強。

圖4 木聚糖酶的最適pH及pH穩定性Fig.4 pH optimum（a） and pH stability（b） of xylanase

表2 木聚糖酶的動力學參數Table 2 Kinetic parameters of xylanase

3 結 語

作者對木聚糖酶AEx11A進行了蛋白質水平的改造， 通過對 AEx11A 中編碼 Thr98、Asn100、Val124、Pro129和Ile132的密碼子實施飽和突變，采用DNS顯色法篩選得到2個酶活性提高明顯的突變子AEx11AT98D和AEx11AV124T，在此基礎上進行迭代飽和突變，篩選得到最優突變子AEx11AT98D-V124Q。純化后突變酶 AEx11AT98D、AEx11AV124T和 AEx11AT98D-V124Q的比活性分別為AEx11A的2.37、1.83和3.04倍。酶學性質研究發現，突變酶AEx11AV124T的熱穩定性較AEx11A有一定提高，各突變酶的pH特性與AEx11A差異不大。突變酶的Km值與AEx11A相比均下降，對底物的親和力增強，AEx11AT98D、AEx11A124T和AEx11AT98D-V124Q的催化效率分別為AEx11A的2.02、1.49和2.74倍。該研究表明，Thr98和Val124位點的分子改造能夠有效改善AEx11A的催化特性，為以后木聚糖酶的進一步改造奠定了理論基礎。

表3 GH11家族木聚糖酶動力學參數比較Table 3 Comparison of the kinetic parameters of several GH11 family xylanases