皮燕麥多酚提取物對冷卻豬肉抗蛋白氧化評價

楊文平，郝教敏，靳明凱，郭安娜，朱月，楊珍平*

(1.華北理工大學 生命科學學院，河北 唐山 063210；2.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；3.山西農業大學 農學院，山西 晉中 030801)

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)約占豬肌肉蛋白總量的50%[1]，其結構的改變，如羰基和巰基含量變化[2,3]，影響肉類的最終品質。肉類制品在加工銷售過程中，極易發生脂質蛋白氧化，可能產生一些有毒化合物[4,5]。為了延長其貨架期，人工合成抗氧化劑如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)等得到廣泛應用[6]。但是，人工合成抗氧化劑長期使用存在的安全隱患引起人們的關注和排斥，開發應用天然抗氧化劑，如黃酮類、多酚類化合物等，已成為食品科技工作者新的研究課題[7-9]。燕麥分裸燕麥(Avenanuda)和皮燕麥(Avenasativa)兩類。在我國，皮燕麥以飼用為主，裸燕麥以食用為主。燕麥富含多種營養成分和抗氧化生物活性物質，如蛋白、脂肪、膳食纖維、多酚化合物、維生素E等[10-12]。研究表明，燕麥多酚具有很強的清除自由基能力及鐵還原能力，能夠防止脂質過氧化和動脈粥樣硬化發生，提高機體內酶活性[13,14]。縱觀前人研究發現，燕麥多酚提取和體外抗氧化性能等方面的研究較多[15-17]，但關于燕麥多酚在肉類制品中抗蛋白氧化機理研究鮮有報道[18,19]。本研究擬將皮燕麥多酚提取物應用于冷卻豬肉，檢測冷卻豬肉中肌原纖維蛋白及其羰基和總巰基含量的變化，評價皮燕麥多酚提取物抗蛋白氧化性能，為皮燕麥開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗原料與試劑

皮燕麥(AvenasativaL.)品種OA1019-1的籽粒：由山西農業大學農學院黃土高原作物研究所提供的引自加拿大的適應性品種。

新鮮豬背最長肌：購于山西農業大學雙匯冷鮮肉店。

2,4-二硝基苯肼(DNPH)：天津市登峰化學試劑廠；鹽酸胍：上海藍季生物有限公司；氯化鈉、氯化鎂、磷酸氫二鈉、石油醚和乙酸乙酯：天津市北辰方正試劑廠；無水乙醇、無水碳酸鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉和三氯乙酸(TCA)：天津市天力化學試劑有限公司；上述試劑均為分析純。

福林酚、茶多酚、牛血清蛋白、三羥甲基氨基甲烷(THAM)和乙二胺四乙酸(EDTA)：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸：大海埃彼化學試劑有限公司；上述試劑均為標準品。

1.2 儀器設備

HCP-100華晨高速多功能粉碎機 浙江省永康市金穗機械制造廠；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋 上海市滬西機電廠；Rotavapor R-3旋轉蒸發儀 瑞士Biichi公司；PL3000凍干機 北京水方儀濤商貿有限公司；FA25型高剪切分散乳化劑 上海弗魯克流體機械制造有限公司；TDL-4離心機 上海安亭科技儀器廠；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；Allegra X-30R臺式冷凍離心機 北京德全興業商貿有限公司；WFJ2100型可見光分光光度計 Unique儀器有限公司；HNY-200D恒溫培養振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 皮燕麥多酚提取物及凍干粉的制備

根據課題組前期的最佳工藝提取皮燕麥多酚。將優選后的皮燕麥籽粒，加適量的水，風干、粉碎、過篩，得到皮燕麥面粉。準確稱取一定量的皮燕麥面粉，用66%無水乙醇，按1∶10料液比，于66 ℃的恒溫水浴鍋中浸提123 min，冷卻至室溫后過濾，所得濾液即為皮燕麥多酚提取液。采用福林-酚比色法測定燕麥多酚含量。將濾液濃縮凍干，即得皮燕麥多酚凍干粉，計算凍干粉中多酚含量為6.01%，放入2～4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 冷卻豬肉處理及實驗設計

將新鮮豬背最長肌去除筋膜、脂肪，攪碎成肉糜，平均分成3份，每份重約300 g。將0.09 g茶多酚、0.15 g皮燕麥多酚分別溶于20 mL無菌蒸餾水中，分別加入到2份肉糜中，剩下的1份肉糜加入20 mL無菌蒸餾水，攪拌均勻后，靜置2 h，即可得到空白組CK、含茶多酚300 mg/kg的陽性對照組和含皮燕麥多酚500 mg/kg的處理組肉樣。

取3組處理好的肉樣各50 g,分別置于聚苯乙烯塑料托盤中，密封，在(1±1)℃冰箱中冷藏。在冷藏期間的0，1，3，5，7 d，提取肉樣肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)，測定蛋白濃度、巰基含量和羰基含量。重復進行3次。

1.3.3 評價指標測定

參照文獻[20]的方法提取肉樣肌原纖維蛋白。方法如下：準確稱量肉樣5 g于100 mL離心管中，加入10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含NaCl、MgCl2和 EDTA，pH 7.0)20 mL勻漿后，在4 ℃離心15 min，棄上清，重復3次；加入0.1 mol/L NaCl洗液40 mL勻漿后，離心15 min，棄上清，重復2次；再加入洗液，勻漿后用兩層紗布過濾，將濾液用0.1 mol/L HCl調pH至6.2左右，離心15 min，棄上清，所得膏狀物即為MP，冰浴保存，備用。

1.3.3.1 MP含量測定

采用雙縮脲法繪制牛血清蛋白標準曲線[21]，其回歸方程為y=0.0396x+0.0151(R2=0.9937)。取1 mL蛋白溶液，加入4 mL雙縮脲試劑和3 mL石油醚充分混勻，離心，用注射針小心將下層溶液吸出，在540 nm處測定吸光度，根據回歸方程計算MP含量。

1.3.3.2 MP羰基含量測定

采取2,4-二硝基苯肼(2,4-Dinitrophenylhydrazine,DNPH)法測定[22]。量取4份25 mg/mL蛋白溶液100 μL于10 mL塑料離心管中，在3個管中分別加入10 mmol/L DNPH溶液2 mL，剩下的管中加入2 mol/L鹽酸2 mL(作對照)，混勻，于4 ℃靜置1 h，然后分別加入20% TCA溶液2 mL，混勻，離心，棄上清，再分別加入4 mL乙醇和乙酸乙酯(1∶1)混合液，混勻，離心，棄上清，重復2次。沉淀風干后，分別加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍，在50 ℃下保溫60 min，在370 nm下測吸光值。

式中：A370為370 nm下吸光度；2.2×104L/(mol·cm)為摩爾吸光系數；106為mmol/mg～nmol/mg的單位轉換系數；C為用鹽酸胍做空白在280 nm下測得的蛋白濃度；羰基含量以nmol/mg蛋白表示。

1.3.3.3 MP總巰基含量測定

參照文獻[23]的方法，采用5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)法測定。根據下列公式計算總巰基含量。

式中：A412為412 nm下吸光度；1.36×104L/(mol·cm)為摩爾吸光系數；106為mmol/mg～nmol/mg的單位轉換系數；C為采用考馬斯亮藍法在595 nm下測得的肉樣蛋白濃度[24]；巰基含量以nmol/mg蛋白表示。

1.4 數據處理與統計分析

采用Excel進行數據整理并制表、作圖；分別應用Statix 8.1和SigmaPlot 10.0進行方差分析和顯著性分析。結果用平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 不同處理對冷卻豬肉MP濃度的影響

不同處理對冷卻豬肉MP濃度的影響見圖1。

圖1 不同處理對貯藏期內冷卻豬肉MP濃度的影響Fig.1 Effects of different treatments on MP content of chilled pork during storage

注：小寫字母不同表示同一處理隨貯存時間延長差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示相同貯藏時間下不同處理間差異顯著(P<0.05)；下同。

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，各組冷卻豬肉MP濃度均呈明顯的下降趨勢(P<0.05)。可能的原因是冷卻豬肉中自由基與蛋白和肽的反應會導致蛋白質肽鏈、氨基酸側鏈的修飾和蛋白質分子間的共價交聯，產生大量羰基和降低巰基含量，這與本研究的測定結果相一致。在同一貯藏期內，冷卻豬肉MP濃度由大到小依次為茶多酚組>皮燕麥多酚組>空白組；貯藏3 d后，空白組比多酚組顯著降低了MP濃度(P<0.05)，表明茶多酚和皮燕麥多酚能抑制豬肉蛋白的氧化。貯藏7 d，皮燕麥多酚組較茶多酚組冷卻豬肉MP濃度顯著降低(P<0.05)，表明茶多酚抑制豬肉氧化效果優于皮燕麥多酚。

2.2 不同處理對冷卻豬肉MP羰基含量的影響

羰基含量最直接指示蛋白質氧化的程度，這也被廣泛用于測量不同氧化脅迫下的蛋白質氧化程度，常被作為蛋白質氧化的靈敏指標[25]。在Fenton反應體系中,蛋白表面氨基酸殘基側鏈基團被氧自由基攻擊，肽鍵斷裂并且產生羰基化合物及其衍生物[26]。羰基的形成是被氧化肌原纖維蛋白中的一個顯著變化。不同處理對冷卻豬肉MP羰基含量的影響見圖2。

圖2 不同處理對冷卻豬肉貯藏期內MP羰基含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on MP carbonyl content of chilled pork during storage

由圖2可知，貯藏0～1 d，各組冷卻豬肉MP羰基含量均處于較低水平，低于0.5 nmol/mg，沒有明顯差異(P>0.05)。隨著貯藏時間延長，豬肉MP羰基含量均呈顯著增加趨勢(P<0.05)，說明貯藏時間與羰基形成有密切關系，這與陳洪生等[27]的研究結果一致。貯藏7 d，各組羰基含量增加幅度不同，從高到底依次為空白組>皮燕麥多酚組>茶多酚組，空白組MP羰基含量顯著高于其他兩個多酚組(P<0.05)，表明空白組MP氧化程度最嚴重，添加多酚具有一定的抗氧化作用，皮燕麥多酚和茶多酚作用相似。可能的原因是多酚與MP共價交聯結合，阻礙了氧化劑的作用部位，或者有效清除了活性氧自由基，阻斷蛋白質羰基鏈式反應，抑制蛋白羰基的形成，從而降低了羰基含量。賈娜等[28]研究表明添加沒食子酸可以降低肌原纖維蛋白的羰基含量，與本研究結果一致。

2.3 不同處理對冷卻豬肉MP總巰基含量的影響

巰基含量是判定蛋白氧化的另一個重要指標，含量越低，說明蛋白氧化的程度越高。不同處理對冷卻豬肉MP總巰基含量的影響見圖3。

圖3 不同處理對冷卻豬肉貯藏期內MP總巰基含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on MP total sulfhydryl content of chilled pork during storage

由圖3可知，0 d時，3組豬冷卻肉MP總巰基含量均較高，達到90 nmol/mg以上；隨著貯藏時間延長，MP總巰基含量總體均呈顯著下降趨勢(P<0.05)，貯藏7 d時，3個處理組MP總巰基含量不超過60 nmol/mg，說明貯藏時間對蛋白巰基含量有顯著影響，這與陳洪生等的研究結果一致。蛋白巰基含量下降的主要原因可能是蛋白質降解導致其空間結構發生改變，致使埋藏在分子內部的巰基暴露出來，半胱氨酸殘基中的巰基(SH-)在氧自由基攻擊下形成二硫鍵(-S-S-)，引起蛋白發生氧化。巰基形成二硫鍵最早是以自由基為媒介發生的[29]。也有研究報道多酚類化合物可以和巰基交聯結合形成巰基-醌加成物,從而引起巰基含量下降[30]。在同一貯藏期內，MP總巰基含量以茶多酚組最高，皮燕麥多酚組次之，空白組最低，茶多酚組與空白組具有顯著差異(P<0.05)。貯藏5 d時，皮燕麥多酚組MP總巰基含量顯著高于空白組(P<0.05)。說明添加多酚類物質在一定程度上可以保護肌原纖維蛋白結構不被自由基所攻擊。可見，皮燕麥多酚具有抑制冷卻豬肉蛋白氧化的作用。

Yang等研究表明[31]，冷藏期間，高氧氣調包裝豬肉隨著脂肪的劇烈氧化，伴隨發生蛋白的劇烈氧化，羰基含量顯著增加，巰基含量明顯減少；添加茶多酚可以部分抑制蛋白氧化。本研究結果與Yang等的研究結果相似，以茶多酚為陽性對照，皮燕麥多酚同樣具有一定的抗蛋白氧化性，可以抑制羰基化合物形成和巰基被氧化。有關多酚化合物對蛋白質的作用機理需進一步深入研究。

3 結論

通過實驗研究發現，在冷藏7 d時，各組冷卻豬肉肌原纖維蛋白都出現明顯的蛋白氧化，羰基含量增加，總巰基含量下降，空白組的氧化程度顯著高于茶多酚組和皮燕麥多酚組(P<0.05)，因此添加皮燕麥多酚可以在一定程度上減少羰基的形成和防止巰基在冷藏過程中的丟失，有效延緩MP氧化程度，提高冷卻豬肉抗蛋白氧化性。將皮燕麥多酚作為天然抗氧化劑，對生產出安全、優質的肉制品具有重要意義。