獼猴桃自然酒精發酵細菌群落分布狀態研究

方月月，解文利，潘肇儀，吳雨桐，周禮紅

(貴州大學 生命科學學院，貴陽 550025)

中國傳統的發酵食品是中華飲食的重要組成部分，發酵食品就是利用微生物發酵作用所生產的一類食品，發酵食品具有益生菌的特性,如抗菌性,抗氧化性等,可通過微生物的作用將對健康有益的成分傳遞給食用者[1]。發酵食品中的微生物與健康有密切的聯系，因此，揭示不同發酵食品中的微生物群落的分布狀態是必要的。鄭曉吉[2]利用Illumina-HiSeq測序技術揭示哈薩克族奶酪發酵過程不同成熟階段微生物群落的演替規律。研究結果表明Lactobacillus和Streptococcus是奶酪微生物群落中的共有細菌屬。陳聰聰[3]通過16S rDNA擴增子高通量測序分析對廣陳皮樣品微生物多樣性進行解析，研究結果揭示了細菌類群屬于厚壁菌門、藍細菌門和變形桿菌門。白光劍等[4]應用高通量測序技術分析成品甜芽菜中具有7個細菌門，包括放線菌門、擬桿菌門、藍細菌門、厚壁菌門、梭桿菌門。折米娜等[5]利用MiSeq高通量測序技術與聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術(PCR-DGGE)相結合的手段對酸菜水中細菌多樣性研究中的微生物多樣性和群落結構進行解析，結果表明酸菜水中的細菌種類較為豐富，其中隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的乳桿菌屬(Lactobacillus)為優勢屬。燕平梅等[6,7]利用DGGE方法研究醬菜中酵母菌多樣性，結果表明發酵醬菜中的酵母菌總共有3個屬，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)為優勢菌種。利用非培養方法研究榨菜中酵母菌的多樣性，結果表明榨菜中有Candidatropicalis,Pichiafermentans,Saturnisporamendonce等酵母菌。

我國擁有很多風味獨特的傳統發酵食品，發酵體系中的微生物對于發酵食品的生產和風味形成十分關鍵。目前對于我國一些發酵食品中微生物多樣性的認識還十分有限[8]。本文報道了采用可培養方法對獼猴桃自然酒精發酵醪中細菌區系進行多樣性研究，研究結果為果蔬發酵食品的品質提高和安全性控制提供了理論基礎，為傳統發酵食品的生產和開發提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

獼猴桃自然酒精發酵醪(酒精度為16%±1%)：實驗室自制。

獼猴桃去雜、去壞果，將獼猴桃用鹽水浸泡30 min后去皮，打漿，加入30%的紅糖，裝瓶，在(25±1) ℃的溫度下自然發酵，當酒精度達到16%±1%時進行取樣。

1.2 藥品與試劑

細菌通用引物(BSF8/20、BSR1541/20)：生工生物工程(上海)股份有限公司合成。細菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、4S green核酸染色劑、DNA Marker-D：購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 主要設備與儀器

S1000 PCR擴增儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司；ABI 3730XL+全自動DNA測序儀 美國ABI公司

1.4 培養基

西紅柿瓊脂培養基、西紅柿汁瓊脂培養基III、BCP培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、MC培養基、MRS培養基、LB培養基I[9-11]。

2 方法

2.1 細菌的分離

取獼猴桃自然酒精發酵醪樣品10 g，放入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩5 min，充分搖勻，稀釋制成10-1菌懸液。將制得的菌懸液梯度稀釋[12]。分別吸取濃度梯度為10-3，10-4，10-5的菌液100 μL置于倒好的平板上。將涂布后的平板置于(37±1) ℃靜置培養2 d，待培養基表面長出單個菌落，其中根據菌落大小、形態、顏色、表面的粗細、透明圈、粘稠度、高低、邊緣的形狀、菌塊的質地等表型特征挑取單菌落，轉接到相應培養基斜面，(37±1) ℃培養2 d，用于菌體制備。

2.2 細菌16S rDNA序列分析

2.2.1 菌體制備

將(37±1) ℃培養2 d備用的細菌斜面菌種用無菌水洗下菌苔，加入到滅菌離心管中，以10000 r/min的速度離心15 s，再將菌體沉淀物用無菌水洗滌2次后用于模板制備。

2.2.2 DNA模版制備

使用購自生工生物工程(上海)股份有限公司的Solarbio細菌基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書方法進行提取DNA。

2.2.3 16S rDNA PCR擴增

以BSF8/20(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、BSR1541/20(5′-AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3′)為引物，以細菌總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：DNA模版1 μL，2×Mix 13 μL，10 μmol/L BSF8/20 1 μL，10 μmol/L BSR1541/20 1 μL，ddH2O 9 μL，混勻后進行PCR反應。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，2～4步循環30次，72 ℃延長10 min。

2.2.4 測序方法

DNA測序采用雙脫氧鏈終止法[13]。

2.2.5 序列分析

利用DNAman軟件拼接序列，啟動Seqman，導入目標序列(峰圖文件)，進行數據修正，數據修正后點擊Assemble進行拼接，若兩個峰圖的重疊區域完全匹配，則表明拼接的結果可靠；若兩個峰圖間有不同堿基，則需要比對兩個峰圖，選擇峰圖清晰的作為最終結果。

采用lgBLASTN(1.14.0)程序搜索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)核酸數據庫，下載得分高、序列相似性達到95%以上相關菌株的16S rDNA序列，選擇的菌株盡可能來源于保藏機構。采用MEGA 10.0.5軟件進行序列比對及聚類分析。

系統發育樹構建方法：利用MEGA 10.0.5軟件的N-J法重構系統發育樹，采用bootstrap檢驗進行評估，bootstrap檢驗1000次。在不同種類的細菌菌株中選取代表菌株，采用N-J法將每一類代表菌株序列與GenBank中的模式菌株序列進行分析，構建系統發育樹，獲得分離菌株的分類地位和系統發育地位(neighbor-joining method，取1000次bootstrap檢驗)[14-16]。

2.3 α多樣性分析

利用R語言(R version 3.5.3 )軟件中Spaa包(spaa_0.2.2)和Vegan包(vegan 2.5-4)分析獼猴桃自然酒精發酵醪微生物的α多樣性，包括Shannon-Wiener指數、Simpson指數、Inverse Simpson指數、物種累計數(S)、Pielou 均勻度指數(J)。

3 結果與分析

3.1 果蔬自然發酵期間發酵醪中細菌的鑒定

從獼猴桃自然酒精發酵醪中共分離得到49株細菌菌株，經對菌株16S rDNA序列進行測序、分析，并利用MEGA軟件對16S rDNA序列進行聚類。49株細菌菌株分別聚成11個獨立類群(見圖1)，提示在獼猴桃自然酒精發酵醪中可能存在多個不同的細菌種類，推測獼猴桃自然酒精發酵醪有可能也是一個多菌株混合發酵的產物。

圖1 49株細菌菌株 16S rDNA序列的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 16S rDNA sequences of 49 bacterial strains

在11個類群中，每一個獨立類群細菌菌株的數量存在差異。其中，第10類群細菌菌株數量最高，第1類群、第9類群和第11類群的細菌菌株數量相同，第5類群的細菌菌株數量最低。結果表明獼猴桃自然酒精發酵醪中存在的不同類群細菌之間可能有特定的消長關系。

3.2 11個細菌類群的鑒定

通過Blast對核酸數據庫搜索比對分析，獲得與聚類確定的11個細菌類群分別相匹配的、相似性大于95%的已知菌株16S rDNA序列。然后將待分析的11個細菌類群代表菌株的16S rDNA序列與數據庫下載序列重構N-J系統發育樹，結果見圖2。

圖2 細菌菌株16S rDNA序列的鄰結法系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of neighborhood method for 16S rDNA sequence of bacterial strains

注：136為1類群代表菌株；209為2類群代表菌株；12為3類群代表菌株；53為4類群代表菌株；46為5類群代表菌株；34為6類群代表菌株；184為7類群代表菌株；25為8類群代表菌株；3為9類群代表菌株；78為10類群代表菌株；81為11類群代表菌株。

第1類群(代表株為136)與已知Serratiamarcescens菌株聚為一支，初步將第1類群鑒定為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。同理，根據N-J系統發育樹的聚類方式，分別將第2類群至第11類群初步鑒定為：奧斯陸莫拉菌(Moraxellaosloensis)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、羅氏菌屬(Rothiasp.)、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusmacroides)、Bacillusaryabhattai、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、黃熱芽孢桿菌(Anoxybacillusflavithermus)。11個細菌類群最后歸于5個屬，分別是芽孢桿菌屬(Bacillus)、莫拉菌屬(Moraxella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)、羅氏菌屬(Rothiasp.)。

3.3 獼猴桃自然酒精發酵醪細菌α多樣性分析

獼猴桃自然酒精發酵醪細菌α多樣性分析表明，果蔬自然酒精發酵達到酒精濃度為16%±1%時，物種累計數(S)為10，PielouA均勻度指數(J)為0.874521，提示發酵醪細菌類群的物種多樣性相對較低；香農-威納指數(Shannon-Wiener)為2.013659，辛普森指數(Simpson)為0.8229904，Inverse Simpson 指數為5.649412，提示發酵醪的細菌類群群落均勻度較低及物種豐富度較低。結果與Jiang等[17]報道的傳統發酵蔬菜微生物的α多樣性一致。細菌多樣性指數分析見表1。

表1 細菌多樣性指數分析Table 1 Analysis of bacterial diversity index

4 結論與討論

通過對獼猴桃自然酒精發酵醪中細菌的分離鑒定分析，其中49株細菌分屬于5個屬10個種。從香農-威納指數、辛普森指數、Inverse Simpson 指數、Pielou 均勻度指數數據分析得知，獼猴桃自然酒精發酵醪中細菌種類多樣性較低，豐富度和均勻度也較低，而物種累計數(S)表明果蔬發酵期間細菌物種數為10。因此，在獼猴桃自然酒精發酵醪當中盡管細菌的豐度較低，但是依然存在。自然發酵其實是一個微生物群落的共發酵，是一個動態變化的微生物生態。

通過本研究可知獼猴桃自然酒精發酵醪中蘊含著豐富的微生物資源，其中蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌屬于可應用于人體的益生菌，進入腸道后通過生物奪氧作用，造成腸道低氧，拮抗腸道致病菌,促進有益菌增長，從而達到調節人體腸道環境的作用[18,19]。地衣芽孢桿菌也是高溫大曲產醬香功能細菌[20]。地衣芽孢桿菌可作為一種益生菌應用于各類食品加工中，為傳統發酵食品產業化生產提供了有利條件。