響應面優化提取灰綠堿蓬多糖及脫色工藝研究

付建鑫，邵家威，方奕珊，張桂香*

(1.濟南大學 食品科學與營養系，濟南 250002；2.齊魯工業大學 食品科學與工程學院，濟南 250353)

灰綠堿蓬(SuaedaglaucaBunge.)，又名黃須菜，是一年生藜科堿蓬屬草本鹽生植物，多生長于灘涂及荒漠處，是鹽堿地的特征植物。近些年來，岸基濕地、灘涂等土壤鹽漬化現象日益嚴重，耕地土壤土質硬化，耕地資源緊缺，迫使人們不得不考慮開發利用鹽生植物資源，所以研究及推廣鹽生植物的種植勢在必行。堿蓬在我國不僅分布廣泛，而且產量高。據統計，每年僅黃河三角洲地區的堿蓬產量就高達3.3×105t[1]。植物多糖除具有一般膳食纖維的特性外，還具有乳化及乳化穩定性、酸性條件下對蛋白顆粒的穩定作用、抗黏結性、成膜性及泡沫穩定性等特性，在食品工業有較多的應用。作為乳化劑已經廣泛地應用在了咖啡奶油、乳化型調味料、咖啡伴侶以及牛奶蛋黃奶油中；作穩定劑的乳飲料類則口感更為清爽。除此之外，在人造奶油、色拉調味油、奶油調味汁等食品中，它可部分代替脂肪，保持水分，增加產品的稠感和黏附感[2]。

目前國內外主要著眼于鹽地堿蓬、硬翅堿蓬耐鹽機理研究及活性物質提取等方面，對灰綠堿蓬的多糖研究暫未報道。本研究以灰綠堿蓬為研究對象，測定了根、莖、葉及全株的基本營養成分，利用響應面法優化提取了堿蓬多糖并對其脫色方式進行了探究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

灰綠堿蓬：采自山東東營；皂土、十六烷基三甲基溴化銨、HZ-800大孔樹脂：國藥集團化學試劑有限公司；石油醚、無水乙醇、硫酸銅、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、葡萄糖等試劑：均為分析純。

702A紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；PHS-3B pH酸度計 賽多利斯科學儀器有限公司；FA2004N 電子天平 上海上平儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰綠堿蓬基本成分測定

1.2.1.1 蛋白質含量測定

按GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》執行。

1.2.1.2 總糖含量測定

按GB/T 15672—2009《食品安全國家標準 食用菌中總糖含量的測定》執行。

1.2.1.3 脂肪含量測定

按GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》執行。

1.2.1.4 黃酮含量測定

按GB/T 20574—2006《蜂膠中總黃酮含量的測定方法 分光光度比色法》執行。

1.2.1.5 皂苷含量測定

按GB/T 22464—2008《大豆皂苷》執行。

1.2.2 灰綠堿蓬多糖提取工藝

通過溶劑浸提法去除植株中少量脂肪及大量可溶性色素[3]。過量正己烷回流脫脂4～6 h，將脫脂后的索式提取系統用少量水沖洗，以75%乙醇為溶劑進行色素沖洗，直至提取管內無顏色變化為止。稱量單位質量的已處理堿蓬干粉(200目)于燒杯中，加入一定量的沸水，封膜密閉后于超聲清洗器中浸提。將冷卻沉降后的提取上清液在8000 r/min 條件下離心10 min并旋轉蒸發濃縮。無水乙醇按照4∶1的比例緩慢倒入濃縮提取液中并攪拌均勻，放置于4 ℃條件下冷藏，每隔3 h攪拌1次，沉淀過夜后，傾倒上層清液。下層溶液在7000 r/min 離心12 min 后，將沉淀用無水乙醇和石油醚洗滌多次后冷凍干燥，即為堿蓬粗多糖，多糖得率計算公式如下：

(1)

1.2.3 灰綠堿蓬多糖提取響應面設計

1.2.3.1 灰綠堿蓬多糖提取單因素試驗

在單因素試驗中，主要考察了提取溫度、提取時間、超聲功率、乙醇體積分數4個因素。其中，控制提取時間為50 min，超聲功率為320 W，乙醇體積分數為65%，提取溫度設定為50，65，75，85 ℃；控制提取溫度為75 ℃，超聲功率為320 W，乙醇體積分數為65%，提取時間選擇30，40，50，60，70 min；控制提取溫度為75 ℃，提取時間為50 min，乙醇體積分數為65%，選擇超聲功率為100，200，320，440 W；控制提取溫度為75 ℃，提取時間為50 min，超聲功率為320 W，選取乙醇體積分數為30%、55%、65%、80%。

1.2.3.2 灰綠堿蓬多糖優化組合試驗

以單因素試驗為前提，采用L9(34)響應面分析法，利用Design-Expert 11.0進行試驗組合模擬。

表1 試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface design

由表1可知，自變量分別為A乙醇體積分數(%)、B提取時間(min)、C超聲功率(W)和D提取溫度(℃)，以-1，0，1分別表示高、中、低3個不同水平。試驗結果以多糖提取得率為響應值(Y)，確定以上4個因素對堿蓬多糖提取的單獨影響和最優組合，結合實際條件優化得到熱水浸提堿蓬多糖的工藝參數。

1.2.4 灰綠堿蓬多糖的脫色研究

1.1.3 試劑 乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher公司)，磷酸二氫鉀(分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司)，甲醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)，其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。小檗堿標準品(批號1161116-02，成都普菲德生物技術有限公司)。

1.2.4.1 HZ-800大孔樹脂吸附法脫色[4]

樹脂預處理：取適用的大孔樹脂于去離子水中充分攪拌分散，沉淀靜置后移去上層清液的懸浮小顆粒，重復此操作3～5次，測定pH為7左右，保證大孔樹脂顆粒的均一性。移除清液，加入2 mol/L的NaOH溶液于40 ℃條件下攪拌2 h反應后于室溫靜置保存8 h，用去離子水沖洗至pH為7左右。同理，2 mol/L HCl按照上述操作(攪拌時封口)。將NaOH-H2O-HCl-H2O處理后的大孔樹脂抽濾，初步脫水，真空干燥后即可使用。

取溶液體積(m/V)的0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8% HZ-800大孔樹脂，與100 mL 10 mg/mL的堿蓬多糖溶液在常溫條件下以 300 r/min攪拌30 min，反應后取上清液測定吸光值，計算脫色率。

1.2.4.2 過氧化氫法脫色[5]

30% H2O2配制成70%(V/V)的過氧化氫溶液。按照每100 mL 10 mg/mL的堿蓬多糖溶液的體積分數，分別加入70%過氧化氫溶液(V/V) 0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%于三角瓶中，50 ℃條件下，以80 W功率超聲25 min，反應后取上清液測定吸光值，計算脫色率。

1.2.4.3 活性炭吸附法脫色[6]

活性炭吸附脫色為常規脫色法，根據報道進行修改。取食品級椰殼活性炭于去離子水中清洗若干次，去除上層懸浮顆粒，烘干后即可使用。分別取0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%質量分數的活性炭加入到100 mL 10 mg/mL的堿蓬多糖溶液中，調節pH至6.3，溫度為40 ℃，攪拌反應1 h，測定吸光值，計算脫色率。

1.2.4.4 復合皂土絡聯法脫色[7]

復合皂土制備：取500 g皂土加入1 L水，劇烈攪拌使其充分分散于溶劑體系，靜置后除去上層懸浮顆粒、結塊，抽濾得水洗皂土。將水洗后的潔凈、均勻皂土分散于10% H2SO4，攪拌均勻后煮沸30 min進行酸化改性，在恒溫水浴鍋95 ℃條件下坐浴6 h，每1 h攪拌1次。反應后的體系放置冷卻至室溫，多次水洗、抽濾并用飽和Na2CO3調節pH 至5.3～5.5，過夜保存后水洗抽濾，110 ℃條件下烘干至恒重，超微粉碎至200目，即為酸改性皂土。重復以上操作，將溶劑替換為7%的十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)和1%的聚丙烯酰胺溶液中，無需調節pH，靜置過夜，烘干粉碎后，即為復合皂土。

分別取溶液體積(m/V)的0.8%、1.3%、1.8%、2.3%、2.8%復合皂土，加入到100 mL 10 mg/mL的堿蓬多糖溶液中，在40 ℃、300 r/min條件下攪拌30 min，反應后靜置室溫于10000 r/min離心10 min，取上清液測定吸光值，計算脫色率。

1.2.4.5 提取率計算

(2)

式中：A為樣品未脫色之前的吸光值；Ax為樣品脫色之后的吸光值；θ為脫色率。

2 結果與分析

2.1 灰綠堿蓬物質成分含量

表2 各物質成分含量Table 2 Content of various substances mg/g

注：“-”表示未測定。

由表2可知，灰綠堿蓬全植株脂肪含量極少，含有部分蛋白質，葉片中的總黃酮、總皂苷和總糖含量較多。

2.2 灰綠堿蓬多糖單因素提取試驗結果與分析

2.2.1 提取溫度對堿蓬多糖提取得率的影響

提取溫度是影響多糖得率的一個重要因素，適宜的溫度有助于提高植物細胞內物質溶出速度和提高多糖溶解度。

圖1 提取溫度對堿蓬多糖提取得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由圖1可知，隨著溫度逐漸升高至75 ℃，多糖得率逐漸升高，此時多糖得率最高，為1.89%。溫度繼續升高，多糖得率明顯下降。這一現象的原因極有可能是過高的溫度使溶出的多糖結構被破壞。因此，提取溫度選擇75 ℃合適。

2.2.2 提取時間對堿蓬多糖提取得率的影響

在一定料液比條件下，隨著提取時間的延長，溶液中溶質的飽和度會達到峰值，在此之后將不再增高。

圖2 提取時間對堿蓬多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由圖2可知、當溫度確定，溶解度一定時，提取時間達到50 min時，體系的多糖含量達到最大，之后多糖提取得率隨著時間的延長將不再變化。提取時間選取50 min適宜。

2.2.3 超聲功率對堿蓬多糖提取得率的影響

當超聲波作用于溶液系統時，由于體系存在張力弱區，溶質在超聲波作用下化學鍵及結構將會被反復斷裂、閉合，使其與物料不斷摩擦碰撞[8]。

圖3 超聲功率對堿蓬多糖提取得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由圖3可知，當超聲功率為320 W時，多糖浸出效果最好，提取得率最高。當超聲功率逐漸增大，多糖得率逐漸下降，原因可能是過高強度的超聲環境對結構化學鍵造成破壞，糖苷鍵斷裂，造成多糖結構被破壞。

2.2.4 乙醇體積分數對堿蓬多糖提取得率的影響

不同比例乙醇體積分數直接影響溶液體系達到過飽和狀態，從而影響多糖的得率。

圖4 乙醇體積分數對堿蓬多糖提取得率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on extraction yield of polysaccharides from Suaeda glauca Bunge.

由圖4可知，乙醇體積分數低于65%時，體系溶液未達到過飽和狀態，只有部分多糖析出；當乙醇體積分數達到65%時，沉淀較為完全，此時最大多糖得率為1.76%，繼續增加乙醇含量，多糖得率變化緩慢。因此，最佳乙醇體積分數選擇65%。

2.3 模型參數與顯著性檢驗

根據響應面試驗設計，29組優化試驗的結果見表3，方差分析及擬合見表4。

表3 提取得率響應面試驗的設計和結果Table 3 Design and results of response surface experiments for the extraction yield

表4 提取得率響應面回歸模型的方差分析(ANOVA)Table 4 The analysis of variance (ANOVA) of the response surface regression model for the extraction yield

注：a表示0.01的顯著水平，b表示0.001的顯著水平。

由表3可知，試驗數據由Design-Expert軟件分析擬合共得到29種組合，得到A，B，C，D和Y的二次多元回歸方程：Y(%)=2.07+0.057A+0.081B+0.12C+0.12D+5.000E-0.003AB-0.020AC+0.030AD+0.045BC+0.027BD+0.040CD-0.21A2-0.065B2-0.071C2-0.067D2。

由表4可知，組合試驗中關于二項式回歸模型的差異性統計分析的結果，P<0.0001說明模型方程在置信度為95%的程度上對多糖產率的擬合估算具有顯著性。失擬項(P=0.6317)表明模型擬合良好，試驗值的誤差相對較小。較好的模型相關系數(R2=0.9499)表明回歸方程可用于試驗實際數據的分析和結果的預測期望。此外，模型變異系數(C.V.)為5.36%，得出結論：該測試可用于統計分析。 A，B，C，D和A2因素對多糖提取得率的影響極顯著(P<0.0001)，而二次項B2、C2和D2則達到顯著(P<0.01)水平。各因素的影響程度排列為：C>D>B>A。AC、BD、BC和CD存在著顯著性異，AB、AD之間影響程度不顯著(P>0.05)，即乙醇體積分數和提取時間二次交互項、乙醇體積分數和提取溫度二次交互項、提取時間和提取溫度二次交互項相互作用較弱，表明這些因素之間與多糖提取得率構建的關系僅為線性關系。

2.4 灰綠堿蓬多糖脫色結果分析

大孔樹脂吸附脫色屬于物理吸附，自身表面具有較大的比表面積，可以依靠樹脂與目標物的范德華力和氫鍵作用力進行吸附[9,10]。吸附效果穩定，不受無機鹽離子及強離子化合物存在的影響，且適用范圍廣，強酸強堿條件下都可以使用，特別是對有機色素吸附效果較好[11]。由圖5中a可知，大孔樹脂吸附脫色整體脫色率處于較高水平，且在較低濃度就可以達到80%脫色率，最佳添加量為1.8%。

圖5 不同處理方式對多糖脫色效果的影響Fig.5 Effect of different treatment methods on the decolorization effect of polysaccharides

過氧化氫在特定條件下，如超聲、加熱條件下可以分解生成原子O[12]，即零價態，具有極強的還原性，可以將有色的物質氧化進行脫色[13,14]，這種脫色屬于化學反應，屬于不可逆反應。由圖5中b可知，H2O2脫色效果隨著添加量增加逐漸增大，當添加量達到2.3%時，體系顏色逐漸穩定。此時，體系中色素物質基本被氧化破壞，在反應中也可以明顯看出體系顏色趨于淺黃色且溶液體系呈清澈狀態。造成這一現象的原因不僅包括色素大分子分解，還包括部分蛋白分子、帶色多酚等物質氧化破壞，這與現有的報道極為相似。

活性炭吸附屬于物理吸附而非化學吸附，主要是利用微小碳粒內密布的孔洞結構來吸附極性較大的分子，具有廣泛性而不具備特異篩選性，故對目標收率產物有一定的影響[15,16]。由圖5中c可知，當活性炭添加量達到1.8%時，脫色效果最佳。當添加量逐漸增加，反應體系的脫色率降低，吸光值逐漸增大，造成這一現象的原因主要是過量的活性炭增加了體系的顏色深度，活性炭的色度比飽和色素的色度高。多糖的研究發現[17]，除pH、溫度等條件外，活性炭添加量是影響脫色的又一重要因素。

黏土類吸附劑脫色原理根據吸附動力學模型研究，分為離子交換吸附和表觀吸附兩種[18]。在表觀吸附方式中，微觀上可以分為化學鍵合吸附和靜電鍵合吸附。化學吸附可以將有色的金屬離子等進行結合，形成不可逆的內絡合層[19,20]；靜電鍵合可以將大分子的色素物質吸附，無選擇性地形成吸附層。研究發現，酸改性皂土對工業廢水，特別是存在金屬顯色離子(Fe2+、Gu2+)的脫色效果較為明顯。由圖5中d可知，當皂土添加量達到1.8%時，色素脫除率達到峰值47.4%，隨著皂土添加量的增加，反應體系脫色率變化平穩，這表明復合皂土對多糖具有一定的脫色效果，但還未能完全脫除色素。脫色效果不足之處可能是因為大分子色素蛋白與糖側鏈結合，降低了皂土吸附效果。

2.5 響應面驗證試驗及脫色方式選擇

選擇活性炭、HZ-800大孔吸附樹脂、過氧化氫和復合皂土的最佳脫色工藝，此時的多糖保留率將影響產物得率。比較活性炭脫色最佳用量1.8%，大孔樹脂脫色最佳用量1.8%，過氧化氫最佳用量2.3%和復合皂土最佳用量1.8%時，4種脫色方式的多糖保留率差異。響應面提取多糖驗證試驗及脫色方式選擇見表5。

表5 脫色效果與多糖保留率Table 5 Decolorization effect and polysaccharide retention rate %

由表5可知，H2O2脫色法損失多糖較多，活性炭和復合皂土法脫色效果遠遠低于HZ-800大孔樹脂。因此，大孔樹脂法脫色為本試驗最優選擇方法。

根據所得理論模型數據，結合實際生產和操作條件可能性，優化數據為乙醇體積分數65%、提取時間72 min、超聲波輔助功率438 W、溫度85 ℃，再次優化條件下進行多次試驗得到多糖提取得率為2.19%±0.13%。與理論得率相比，數據平穩，誤差較小且與預測值相近，證明該響應面提取多糖的分析方法可行、數據可靠，具有理論和實際應用價值。

3 結論

堿蓬多糖是一種具有維持細胞滲透壓，防止水分流失的非還原性糖，由于其獨特的生物特性被人們逐漸認知。高滲地區生長環境具有高濃度的鹽離子含量，未脫鹽的粗糖使其成為一種集調味品與功能性添加劑為一體的食品添加劑。探究適合高鹽成分多糖的脫鹽方式及其參數，可以對肉類、果蔬、味精等增鮮調味品提供應用的理論基礎。

試驗理論方程模型較好地模擬了提取溫度、提取時間、超聲功率、乙醇體積分數和多糖提取率之間的關系，試驗數據準確，實際提取結果與理論預測值相近。結合實際生產情況確定了乙醇體積分數65%、提取時間72 min、超聲功率438 W、提取溫度85 ℃為最佳提取參數，此時堿蓬多糖提取得率達到2.19%±0.13%。多糖脫色研究中，考慮在最低脫色劑使用量和脫色效果最優情況下，選擇HZ-800大孔樹脂作為堿蓬多糖的脫色方式，此時大孔樹脂脫色最佳用量為1.8%，脫色率為95.51%，多糖保留率為79.62%。