基于培養鑒定法和高通量測序技術分析郫縣豆瓣微生物群落結構演替

楊林子，盧云浩，何強

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

郫縣豆瓣是以優質的辣椒和蠶豆為主要原料，經多種微生物發酵而成的半固態調味品，具有味辣香醇、紅棕油亮、瓣粒酥脆、黏稠絨實、醬香濃郁的特點，堪稱“川菜之魂”[1]。郫縣豆瓣的生產包括辣椒發酵、制曲-蠶豆發酵和混合后熟發酵3個階段，其釀制采用開放式的發酵體系[2]，利用發酵環境中的各類微生物進行物質代謝、轉換和信息傳遞，從而形成郫縣豆瓣獨特的品質特征。但由于其微生物區系復雜，造成了目前發酵過程難于控制、產品品質不穩定等問題[3]。因此，為實現郫縣豆瓣的定向控制發酵，提高生產效率，確保產品質量與安全，需對郫縣豆瓣發酵過程中的微生物群落演替規律進行系統深入的認識。

近年來，高通量測序技術因產量大、錯誤率低、性價比高、靈活性好等優點，已廣泛應用于發酵食品微生物多樣性的研究，如意式Salami、韓式Doenjang、日式Miso等[4-6]，但該技術可以將樣品中葉綠素及死菌DNA測定在內，導致微生物多樣性結果往往高于樣品實際情況。因此，多方法聯用分析能更真實地反映食品中微生物的群落結構，本研究同時采用傳統培養鑒定法和Illumina MiSeq測序技術分析郫縣豆瓣3個發酵階段的微生物群落演替情況，以揭示郫縣豆瓣發酵過程中微生物的動態變化，為更好地認識傳統發酵食品的發酵機制、優化發酵工藝、控制食品質量提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：取自郫縣某豆瓣生產工廠，具體生產工藝見本團隊研究成果[7]。本實驗選取5個樣品點：辣椒發酵末期、蠶豆發酵中期、蠶豆發酵末期、混合發酵中期、混合發酵末期(分別編號為1，2，3，4，5)。取樣時從每個發酵池的上層(距表面0～20 cm)、中層(距表面30～50 cm)、下層(距池底0～20 cm)各取25.0 g左右，將其混合均勻，低溫密封運送至實驗室，于-80 ℃保存備用。

培養基：北京藍橋生物技術有限公司；DNA提取試劑盒、Tris HCl、dNTP、引物：上海生工生物科技有限公司；E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒：美國Omega公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen公司；其他化學試劑：均為分析純，成都科龍化工有限公司。

1.2 儀器與設備

P-330納米光度計 Implen公司；Illumina MiSeq測序儀 Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 培養鑒定法

1.3.1.1 樣品微生物計數、分離與純化

將郫縣豆瓣樣品研磨均勻，準確稱取25.0 g樣品加至225 mL無菌生理鹽水中充分混合后，進行梯度稀釋(10-1～10-6)并涂布在YPD、NB及GAM培養基平板上，分別在28，37，37 ℃厭氧條件下培養后進行微生物計數，挑取形態各異的單一菌落進行分離純化，采用相應液體培養基擴培后置于-80 ℃甘油中保藏備用，無菌水代替菌液作為空白組。

1.3.1.2 DNA提取與鑒定

微生物DNA依據細菌、真菌提取試劑盒說明書提取。

細菌PCR反應體系：25 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA模板，引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)10 μmol/L各2 μL，20 μL ddH2O。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃保持10 min。

真菌PCR反應體系：25 μL 2×PCR Mix，1 μL DNA模板，引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′) 10 μmol/L各1 μL，22 μL ddH2O。反應條件同細菌。

PCR擴增產物利用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托成都生工生物技術有限公司進行測序。

1.3.2 高通量測序技術

1.3.2.1 DNA的提取

依據E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒提取樣品中的DNA。

1.3.2.2 PCR擴增及MiSeq測序

PCR擴增，分別用338F(5′-GGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′)/806R(5′-GGACTACHVGGGTW-TCTAAT-3′)和ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAG-GAAGTAA-3′)/2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCG-ATGC-3′)通用引物對細菌16S rRNA和真菌ITS進行MiSeq測序，采用FastPfu DNA聚合酶進行PCR反應，每組樣品設置3個平行，并利用2%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris HCl洗脫后進行熒光定量。根據TruSeqTM DNA試劑盒的說明書對PCR產物進行測序。

1.4 數據處理

通過Flash軟件對1.3.2.2中所得序列進行拼接、過濾和優化，采用QIIME Pipeline去除低質量的數據，得到高質量序列進一步分析。以97%的相似性對操作分類單元(OTUs)進行分類，微生物α多樣性利用香農指數(Shannon index)和Bayesian算法表示。

2 結果與分析

2.1 郫縣豆瓣不同發酵階段菌落總數

真菌、好氧細菌(含兼性厭氧細菌，下同)和厭氧細菌(含兼性厭氧細菌，下同)在郫縣豆瓣各發酵階段表現出了不同的變化，見表1。

表1 郫縣豆瓣不同發酵階段菌落總數Table 1 Total bacterial colony number of Pixian broad bean paste at different fermentation stages CFU/g

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發酵中期，3為蠶豆發酵末期(甜瓣子)，4為混合發酵中期，5為混合發酵末期(郫縣豆瓣)。

辣椒發酵階段，生物量約為0.08×104～4.6×104CFU/g，均在較低水平，可能是由于發酵的高鹽環境所致。蠶豆發酵階段，由于米曲霉的接種，初期真菌總數達1.05×109CFU/g(數據未顯示)，但隨著發酵的進行，真菌總數不斷下降，甜瓣子中真菌生物量降至1.1×104CFU/g；而好氧細菌的生物量大致維持在1.0×106CFU/g左右，高于厭氧細菌含量。混合發酵階段，真菌總數不斷增加，末期含量約為1.1×105CFU/g；好氧細菌一直維持在1.4×105CFU/g；厭氧細菌為該階段的劣勢菌，這可能是由于該階段的定期翻缸，使得基質氧氣均勻充足，不利于厭氧細菌的生長[8]。總體來看，在整個發酵過程中，蠶豆發酵階段的菌落總數最高，好氧細菌和真菌為主要優勢菌落。

2.2 培養鑒定法分析微生物群落結構

通過培養法共鑒定到12個屬，27個種的微生物，見表2。

表2 基于傳統培養鑒定法分析郫縣豆瓣微生物多樣性Table 2 Analysis of microbial diversity of Pixian broad bean paste based on traditional culture identification method

續 表

細菌的多樣性及組成見圖1。

圖1 基于傳統培養鑒定法分析郫縣豆瓣不同發酵階段的細菌群落結構Fig.1 Bacterial community structure of Pixian broad bean paste during different fermentation stages based on traditional culture identification method

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發酵中期，3為蠶豆發酵末期(甜瓣子)，4為混合發酵中期，5為混合發酵末期(郫縣豆瓣)。

由圖1中A可知，好氧細菌中，整個發酵過程總體以Bacillussp.和Gracilibacillussp.為主要優勢菌屬。辣椒發酵階段微生物多樣性最為豐富，以Bacillusamyloliquefaciens和Gracilibacillustimonensis為主，兩者占比達56.02%；蠶豆發酵階段與混合發酵階段菌落組成相似，均以Bacillusamyloliquefaciens，Bacillussubtilis，Bacillusmethylotrophicus為優勢菌，但組成比例有一定差異，B.amyloliquefaciens含量在兩個發酵階段整體均呈上升趨勢，最終占比分別為63.96%和72.93%；B.subtilis含量在蠶豆發酵后期有所減少，混合發酵階段基本維持穩定，它是豆瓣中主要的腐敗菌，但可以很好地抑制黃曲霉毒素的生長[9]。

由圖1中B可知，厭氧細菌中，辣椒及蠶豆發酵階段均以Tetragenococcushalophilus為優勢菌，分別占比51.25%和71.19%，混合發酵階段，Bacilluslicheniformis，Oceanobacillustimonensis兩者占比達到95%以上，而T.halophilus幾乎檢測不到，這可能是由于T.halophilus有更好厭氧環境，而混合發酵階段的定期攪拌使得發酵環境中氧含量充足。

對真菌而言，辣椒發酵階段以Candidaetchellsii，Zygosaccharomycesrouxii為優勢菌，兩者占比分別為57.14%和32.65%，見圖2。

圖2 基于傳統培養鑒定法分析郫縣豆瓣不同發酵階段的真菌群落結構Fig.2 Fungal community structure of Pixian broad bean paste during different fermentation stages based on traditional culture identification method

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發酵中期，3為蠶豆發酵末期(甜瓣子)，4為混合發酵中期，5為混合發酵末期(郫縣豆瓣)。

蠶豆發酵階段，由于微氧及高鹽環境，初期接種的Aspergillusoryzae隨著發酵的進行占比不斷減少，到末期僅占0.88%，這與蠶豆發酵階段的真菌總數測定結果一致(見表1)；Candidaversatilis占比達到70%以上，Z.rouxii次之，約占20%。由于辣椒胚和甜瓣子的混合，混合發酵中期展現出最為豐富的真菌多樣性，隨著發酵的進行，部分微生物逐漸消亡，后期菌群由C.versatilis，Z.rouxii和C.etchellsii共同組成，三者占比分別為72.82%、13.59%、13.59%。

2.3 微生物多樣性分析

微生物群落的多樣性、豐富度及測序深度分別采用Shannon指數、Chao 1及Coverage來評估。

表3 基于97%相似水平的微生物群落多樣性指數Table 3 Microbial community diversity indexes based on 97% similarity level

續 表

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發酵中期，3為蠶豆發酵末期(甜瓣子)，4為混合發酵中期，5為混合發酵末期(郫縣豆瓣)。

由表3可知，各樣本的Coverage均大于99.9%，表明目前的測序深度較為合理，可以很好地反映樣本中微生物的多樣性變化情況。整體而言，蠶豆發酵階段的細菌多樣性最高，細菌豐富度最低；真菌多樣性和豐富度在蠶豆發酵階段均最低，這可能與米曲霉的接種有關。

2.4 Illumina MiSeq測序分析微生物群落結構

圖3 Illumina MiSeq測序分析細菌群落組成變化Fig.3 Analysis of the change of bacterial community composition by Illumina MiSeq sequencing

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發酵中期，3為蠶豆發酵末期(甜瓣子)，4為混合發酵中期，5為混合發酵末期(郫縣豆瓣)。

從門水平來看，細菌群落共歸屬于5個門。由圖3中A可知，相對豐度在1%以上的有Firmicutes，Cyanobacteria，Proteobaceria和Actinobacteria，這與Li等[10]的研究結果一致。辣椒發酵階段以Cyanobacteria為主，其相對豐度約為76.2%；蠶豆發酵階段，Firmicutes處于主導地位，Proteobaceria次之，兩者相對豐度之和大于97%；混合發酵階段，Firmicutes相對豐度隨發酵進行不斷增長，在末期其占比達94.4%。

從屬水平來看，5個樣本包括129個屬的細菌。由圖3中B可知，辣椒發酵階段以norank-c-Cyanobacteria為主，其相對豐度約76.2%。蠶豆發酵階段，細菌群落多樣性豐富，隨著發酵進行，Bacillussp.逐漸成為優勢菌屬，甜瓣子中其相對豐度約為35.6%；另外，Citrobactersp.，Lactobacillussp.，Enterobactersp.和Lactococcussp.也同樣占據重要地位，相對豐度分別為12.03%、14.1%、7.82%、1.56%。混合發酵過程主要表現為Bacillussp.的顯著增加，末期其相對豐度達93.6%，為主要的微生物群落。

圖4 Illumina MiSeq測序分析真菌群落組成變化Fig.4 Analysis of the change of fungal community composition by Illumina MiSeq sequencing

注：1為辣椒胚，2為蠶豆發酵中期，3為蠶豆發酵末期(甜瓣子)，4為混合發酵中期，5為混合發酵末期(郫縣豆瓣)。

郫縣豆瓣的真菌群落歸屬于4個門，由圖4中A可知，相對豐度在1%以上的有Ascomycota，Basidiomycota，unclassified_k_Fungi。辣椒發酵階段以Ascomycota和Basidiomycota占優勢地位，兩者相對豐度約為99.8%。蠶豆發酵階段及混合發酵階段Ascomycota相對豐度達到95%以上，在真菌群落結構中占據主導地位。

從屬水平來看，樣品中真菌群落共鑒定到70個屬的微生物，其中相對豐度在1%以上的見圖4中B。辣椒發酵階段以Aspergillussp.，Alternariasp.，Wallemiasp.，Cryptococcussp.和Candidasp.為優勢菌群，占比分別為38.15%、18.83%、15.37%、13.0%、5.78%；蠶豆發酵階段，Aspergillussp.的相對豐度始終維持在99.0%以上；混合發酵階段菌落多樣性較為豐富，但仍以Aspergillussp.為優勢菌屬，到末期相對豐度增至84.8%。

前人曾對郫縣豆瓣中的微生物進行了大量的相關研究和報道，如張琦等[11]運用PCR-DGGE技術研究了郫縣豆瓣自然發酵過程中細菌群落結構的變化，揭示了細菌群落變化較為明顯，且Staphylococcusxylosus和乳酸菌為優勢細菌；汪先丁等[12]利用PCR-DGGE指紋圖譜技術研究郫縣豆瓣自然發酵過程中真菌群落的演替，結果顯示Aspergillusoryzae是發酵前期的優勢真菌。本研究采用的兩種方法均有鑒定到Bacillussp.，Gracillibacillussp.，Staphylococcussp.，Aspergillussp.，Candidasp.和Zygosaccharomycessp.，有效地證實了在郫縣豆瓣發酵過程中這些微生物的存在。然而，兩種方法鑒定結果也存在一定的差異，一些微生物如norank-c-Cyanobacteriasp.，Citrobactersp.，Alternariasp.，Wallemiasp.和Cryptococcussp.僅被Illumina MiSeq測序鑒定為優勢菌屬，一方面是因為現階段許多微生物還不能被選擇性培養基培養[13]；另一方面，辣椒葉綠素DNA序列與norank-c-Cyanobacteria序列相似，可能導致高通量測序結果錯誤[14]。此外，Illumina MiSeq測序結果表明Aspergillussp.在蠶豆發酵和混合發酵階段均占據絕對優勢地位，但培養鑒定法表明其在發酵過程中快速死亡，在成品中并未被鑒定到。Lactobacillussp.，Weissellasp.，Penicilliumsp.也有類似情況，它們僅在蠶豆發酵初期被鑒定到(數據未顯示)，這可能是由于Illumina MiSeq測序可以檢測到死亡微生物群落但DNA未降解的核苷酸序列[15]。因此，結合傳統培養法和高通量測序分析可以為了解郫縣豆瓣3個發酵階段的微生物群落演替提供補充支持。

3 結論

通過培養鑒定法和Illumina MiSeq測序技術結合分析郫縣豆瓣的微生物群落結構，實驗結果顯示：在整個發酵過程中，細菌的群落組成變化較大，其中蠶豆發酵階段的微生物菌落總數最高，混合發酵展現了豐富的微生物多樣性。辣椒發酵階段，真菌以Aspergillussp.，Alternariasp.，Wallemiasp.，Cryptococcussp.，Candidasp.為優勢菌屬，細菌以Gracilibacillussp.，Bacillussp.為優勢菌屬。蠶豆發酵細菌主要包括Bacillussp.，真菌以Candidasp.，Zygosaccharomycessp.的豐度較高。混合發酵階段，好氧細菌和真菌占比均衡，分別以Bacillussp.,Candidasp.，Zygosaccharomycessp.為優勢菌屬。結合兩種分析方法全面、真實、有效地反映了郫縣豆瓣發酵過程中微生物的多樣性及菌群組成，揭示了微生物群落結構演替過程，可為后續優化郫縣豆瓣的發酵工藝提供理論指導。