一株產藍色素放線菌篩選鑒定與性質初探

劉曉飛，鄭志輝，宋潔，劉美茜，關樺楠，張娜，王薇

(哈爾濱商業大學 食品工程學院，哈爾濱 150076)

色素又被稱為色階、著色劑等，是食品添加劑的重要組成部分[1]。食品的顏色對吸引消費者和評價產品質量起著重要的作用[2]。色素可以增加食品的色澤、延長食品的貯藏時間，是決定食品質量的重要因素之一[3,4]。色素分為天然色素和合成色素。近年來的研究表明合成色素有毒性，進入人體后會使染色體斷裂，使細胞死亡并失去輸氧能力[5]，而天然色素因安全可靠、無毒副作用且可提供營養而被人們廣泛關注。天然色素可從各種植物、動物、微生物等中提取。微生物色素的生產具有來源廣、成本低、產量高等優點。放線菌是色素的主要來源，放線菌色素包括放線紫素、石蕊殺菌素和花青素等[6-8]，其色素多用作抗生素、營養劑和食品保護劑[9]，還可用作抑菌劑及多種食品的著色劑等[10]。因此，放線菌產生的色素對食品行業具有重要的作用和意義。

土壤是放線菌篩選的重要來源，不同的、獨特的地容地貌為新型放線菌的篩選提供了更多的選擇。Gan Renyou 等[11]從食用豆皮的提取物中發現了原花青素，且原花青素表現出高抗菌和抗氧化作用。Domenico Carminati等[12]在芝士工廠篩選到了產藍色素的假單胞菌并且以此為指標控制奶酪變質。Selvakumar Dharmaraj等[13]從白花海綿狀愈傷組織中分離到白色系鏈霉菌(AQBWWS1)，經熒光白光發酵后產生食品級色素(類胡蘿卜素)。本實驗從東北寒地黑土中分離篩選出產色素的放線菌，探索了寒地黑土的微生物菌種及其代謝產物，獲取了一種有應用價值的代謝產物，根據培養和形態學特征對其進行了放線菌菌株的鑒定，并對色素的性質做出探究，為此放線菌色素的使用條件提供了參考，為天然色素的開發應用拓寬了領域。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土樣來源

黑龍江省牡丹江市(東經128°02′～131°18′、北緯43°24′～45°59′)。

1.1.2 培養基

高氏1號液體培養基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.8 g，氯化鈉0.8 g，硫酸鎂0.8 g，硫酸亞鐵0.05 g。

高氏1號固體培養基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.8 g，氯化鈉0.8 g，硫酸鎂0.8 g，硫酸亞鐵0.05 g，瓊脂粉20.0 g。

燕麥汁瓊脂(ISP3)固體培養基：燕麥片20.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.8 g，氯化鈉0.8 g，瓊脂粉20.0 g。

指示菌培養基LB：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂5 g。

1.1.3 實驗儀器

BS-224-S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器、KQ-250DE臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SHB-IV分光光度儀 鄭州長城科工貿有限公司；DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海申安醫療器械廠；DHP-9162電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；KQ-250DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 菌種篩選

將土樣晾干后取5 g，將其研磨后加入無菌水制成懸液，放入搖床于28 ℃、180 r/min振蕩1 h后將懸液過濾后得到原液，將原液依次稀釋至10-5，選取濃度為10-3、10-4和10-5的稀釋液涂布在高氏1號固體培養基上并在28 ℃下進行培養。

15 d后將平板中的放線菌挑出并將其接種到燕麥培養基上，若沒有單一菌落可再次傳代，直到得到單一菌落，命名為GS-1。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 形態特征觀察和染色

將菌株GS-1接種于ISP3固體培養基上，28 ℃下恒溫培養3～4 d后，觀察菌落大小、顏色、邊緣狀況。

將菌株GS-1接種于GY液體培養基中，28 ℃、180 r/min下恒溫振蕩培養3～4 d，取菌液置于載玻片上，固定后用番紅染色，觀察菌絲形態。

1.3.2 分子生物學鑒定

液體培養：用接種鏟從長滿孢子的斜面培養基上刮取GS-1菌落，并將其接種在GY液體培養基中，180 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養3～4 d。

分子生物學鑒定：參考李小霞等[14]采用的DNA提取、PCR擴增和電泳實驗方法。

建樹：通過MEGA 6.06軟件中的鄰近連接方法構建系統發育樹，最后通過比較獲得的序列，通過鄰接法(NJ)構建系統發育樹[15]。

1.4 色素提取

1.4.1 SDS提取法

稱取2 g的SDS溶于100 mL水中配制成2%的SDS，調節pH至12待用；取10 mL發酵液，加入濃度為2%的SDS(pH 12)，50 ℃下攪拌25 min后以5000 r/min離心20 min。重復上述操作，直至沉淀發白，吸取上清液測定波長259 nm下的OD值。

1.4.2 堿提取法

取10 mL發酵液，將pH調至9，以5000 r/min離心20 min，取上清，于波長259 nm下測OD值。

1.4.3 超聲提取法

取10 mL發酵液，置于100%功率的超聲波清洗機中，在50 ℃下超聲處理20 min，以5000 r/min離心20 min，取上清，于波長259 nm下測OD值。

1.4.4 藍色素的提取得率

藍色素提取產率定義為通過每種方法提取的色素溶液測量的OD值與通過SDS提取方法提取的色素溶液測量的OD值之間的比率。

1.5 色素性質研究

1.5.1 藍色素紫外-可見吸收光譜掃描

取GS-1所產的藍色素配成溶液，在200～700 nm下掃描UV-可見吸收光譜。

1.5.2 溶解性實驗

吸收相同量的樣品溶液，加入水、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中，并與10 mL各溶劑充分混合以觀察溶解情況。

1.5.3 抑菌性實驗

使用牛津杯法測定藍色素對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽性菌(白葡萄球菌)的抑制作用。

1.5.4 穩定性實驗

1.5.4.1 pH對藍色素穩定性的影響

各取10 mL稀釋的原液，分裝在5個100 mL Erlenmeyer燒瓶中，將稀釋原液的pH值分別調至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，將在室溫下避光儲存的稀釋儲備溶液用作空白對照，并在259 nm下測其OD值。

1.5.4.2 直射光照射時間對藍色素穩定性的影響

取50 mL稀釋原液，置于日光下照射10 h (9∶30-19∶30)，每隔2 h取樣10 mL，將在室溫下避光儲存的稀釋儲備溶液用作空白對照，并在259 nm下測其OD值。

1.5.4.3 紫外線照射時間對藍色素穩定性的影響

取50 mL稀釋原液，置于無菌操作臺上T以紫外光照射10 h，每隔2 h取樣10 mL，將在室溫下避光儲存的稀釋儲備溶液用作空白對照，并在259 nm下測其OD值。

1.5.4.4 NaCl濃度對藍色素穩定性的影響

取50 mL稀釋原液，分裝在5個小試管中，每個10 mL。分別向試管中加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的NaCl溶液，將在室溫下避光儲存的稀釋儲備溶液用作空白對照，并在259 nm下測其OD值。

1.5.4.5 金屬離子對藍色素穩定性的影響

取50 mL稀釋原液，分裝向5個小試管中，每個10 mL。分別向試管中加入1 mol/L的NaCl溶液、KCl溶液、MgCl2溶液、CaCl2溶液、BaCl2溶液，將在室溫下避光儲存的稀釋儲備溶液用作空白對照，并在259 nm下測其OD值。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選結果

在ISP3固體培養基上菌株GS-1的菌落形態見圖1～圖3，番紅染色的鏡檢結果見圖4。

圖1 GS-1菌落形態(正)Fig.1 GS-1 colony morphology (obverse)

圖2 GS-1菌落形態(反)Fig.2 GS-1 colony morphology (reverse)

圖3 GS-1單菌落Fig.3 GS-1 single colony

圖4 GS-1鏡檢Fig.4 GS -1 microscopy

菌株GS-1的放射狀灰色菌絲向四周匍匐生長，菌絲較稀疏，氣生菌絲較少，菌絲層較薄，菌落呈規則圓形，因菌絲生長速度不同，邊緣不齊；孢子為灰色，由中心向四周蔓延，其密度分布呈明顯的波浪帶狀，整體孢子密度大；中間有氣生菌絲微微向上凸起，基內菌絲呈藍色，產生藍色色素。

番紅染色后鏡檢可見菌株GS-1的菌絲呈明顯的絲狀，與基內菌絲相比氣生菌絲更粗。

2.2 分子生物學鑒定結果

PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳見圖5。PCR擴增后的產物經凝膠回收后，將質粒送去測序，獲得GS-1的16S rRNA序列，共1589 bp，菌株GS-1的系統發育樹見圖6。

圖5 瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.5 Results of agarose gel electrophoresis

圖6 基于16S rRNA和相關菌株的菌株GS-1的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain GS-1 based on 16S rRNA and related strains

注：分支處僅顯示出>50%的靴值，0.001代表兩個核苷的遺傳距離。

與菌株GS-1高度同源的菌株為鏈霉菌，同源性最高的菌株為Streptomycestauricus(AB045879)，同源率達99.93%。選取同源性>98%的相關菌株，通過MEGA 6.06軟件中鄰近連接法構建系統發育樹(見圖6)，并分析其進化關系。結果表明：在構建的系統發育樹中，菌株GS-1與Streptomycestauricus形成單一且穩定的分支，靴值為67%，其被確定為鏈霉菌屬。

2.3 藍色素紫外-可見吸收光譜掃描

藍色素在200～700 nm處紫外-可見吸收光譜掃描結果見圖7。

圖7 藍色素紫外-可見吸收光譜掃描Fig.7 UV-visible absorption spectrum scanning of blue element

由GS-1所產藍色素最大吸收波長為259 nm，此時的最大吸收峰為1.6519。

通過各提取方法測得的OD值與藍色素提取得率見表1。

表1 藍色素提取得率表Table 1 Extraction rates of blue pigment

由表1可知，SDS提取法對該藍色素的提取效果最好，堿提取法其次，提取得率為60.2%，超聲提取法效果相對較差，提取得率為50.4%。

2.4 色素性質研究

2.4.1 溶解性實驗結果

相同量的色素在不同溶劑中的溶解情況見表2。

表2 不同溶劑中色素的溶解情況Table 2 Dissolution situation of pigment in different solvents

由表2可知，鏈霉菌GS-1所產藍色素易溶于水，而不易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑，為水溶性色素。

2.4.2 抑菌性實驗

藍色素對大腸桿菌和白葡萄球菌的抑菌效果見表3。

表3 色素抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of pigment

2.4.3 穩定性實驗

2.4.3.1 pH對藍色素穩定性的影響

pH對藍色素穩定性的影響見圖8。

以該色素溶液的原液作對比，當溶液的pH為2.0～6.0時，色素相對穩定，在樣品的pH超過8.0時，樣品的OD值顯著升高。在不同的pH條件下色素有不同的顏色，當樣品溶液的pH為酸性時，溶液顏色為粉紅色；當樣品溶液的pH為堿性時，溶液顏色為藍色，且pH越高藍色越深，與李一葦等的實驗結果基本一致[16]。

2.4.3.2 光照時間對藍色素穩定性的影響

直接光照時間對藍色素穩定性的影響見圖9。

圖9 直射光光照時間對藍色素穩定性的影響Fig.9 Effect of direct light duration on stability of blue pigment

以該色素溶液的原液作對比，隨著直射光光照時間的增長，樣品的OD值顯著降低。直射光光照時間在2～6 h(9∶30-15∶30)內，樣品的OD值隨著時間增長而變小；在第8 h(15∶30-17∶30)時，色素的OD值上升；在第8～10 h(17∶30-19∶30)時，樣品的OD值下降。 此結果與吳恒[17]的實驗結果差距較大，可能是因為設置測定的時間間隔不同。

2.4.3.3 紫外光光照時間對藍色素穩定性的影響

紫外光光照時間對藍色素穩定性的影響見圖10。

圖10 紫外光光照時間對藍色素穩定性的影響Fig.10 Effect of ultraviolet light duration on stability of blue pigment

以該色素溶液的原液作對比，色素在紫外光下光照時間越長，穩定性越差，與吳恒的實驗結果基本一致。該色素儲存時應小心儲藏，以避免暴露在紫外線下。

2.4.3.4 NaCl濃度對藍色素穩定性的影響

NaCl濃度對藍色素穩定性的影響見圖11。

圖11 NaCl濃度對藍色素穩定性的影響Fig.11 Effect of NaCl concentration on stability of blue pigment

以該色素溶液的原液作對比，該樣品在有Na+存在的情況下穩定性較差，NaCl濃度為0.4 mol/L時，色素的OD值最大。本實驗結果說明Na+有一定的增色作用。

2.4.3.5 金屬離子對藍色素穩定性的影響

金屬離子對藍色素穩定性的影響見圖12。

圖12 金屬離子對藍色素穩定性的影響Fig.12 Effect of metal ions on stability of blue pigment

以該色素溶液的原液作對比，樣品在5種金屬離子影響下OD值均有所升高，Ba2+對色素溶液的OD值有很大影響，而其他4種離子對樣品溶液的影響較小，與韋瑤等的研究結果基本一致[18]。加入Ba2+后，由于絡合物的形成，色素溶液較渾濁，因此在使用此色素時，應盡可能避免其與Ba2+接觸。

3 結論與討論

天然色素在食品方面不僅可以作為增色劑，還可以作為食品的包裝材料，具有非常大的應用價值。我國目前食品中允許使用的藍色素只有兩種，即梔子藍色素和藻藍色素，因此，藍色素的開發和使用就顯得尤為重要。Zhu Yunping等從鏈霉菌A1013Y中分離到一種新型藍色素，純化后組分為4,8,13-三羥基-6,11-二氫-三氫花青素A(TDTA)，此種色素可有效清除人體自由基[19]。邊名鴻等[20]從類芽孢桿菌XF-105中提取了紅色素并對其穩定性進行了探究，發現該紅色素溶于乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等，微溶于水，不溶于正丁醇；pH、溫度、氧化劑、還原劑及常用食品添加劑等對該色素的穩定性影響較小，光照對色素穩定性影響顯著；Mg2+、K+、Na+對紅色素穩定性基本沒有影響，Mn2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+等金屬離子對紅色素都有不同程度的消色作用。

天然的藍色素具有很強的抑菌作用，在食品保藏方面具有很大前景。根據寒地黑土的特殊生態環境，分離篩選出一株產藍色素的放線菌，對其進行形態、培養特征及分子生物學鑒定并通過構建發育樹將該菌株GS-1確定為鏈霉菌屬，并制備了微生物的代謝產物。本研究所獲得的藍色素在酸性條件下為粉紅色，在堿性條件下藍色素顏色加深；當溶液中存在NaCl時，它是穩定的，當NaCl的濃度為0.4 mol/L時，對色素有明顯的增色作用；當Na+、K+、Ca2+、Mg2+存在時，對色素影響較小，若Ba2+存在，則色素溶液變渾濁。該色素對大腸桿菌和白葡萄球菌均有抑制作用，避光穩定性較強，該菌株具有進一步研究的價值。