超聲輔助乙醇提取海帶多酚工藝優化及抗氧化活性

蘇艷玲，張謹華

(晉中學院 生物科學與技術學院，山西 晉中 030619)

在我國，海帶有著悠久的食用傳統，在許多古代醫學典籍中都有提及[1]，它是人們喜食的一種經濟和營養價值兼具的多年生海藻食物，生長環境特殊，代謝物質獨特，多分布于熱帶、溫帶的低溫海域中。近年來，隨著對海洋資源的不斷開發，已有部分學者從海藻中分離得到多種可清除體內自由基、具有抗氧化作用的海藻活性物質[2]，如裙帶菜多肽、海藻多酚等[3]。海帶多酚是以間苯三酚為結構單元的聚合物，是一類重要的褐藻多酚化合物，褐藻多酚具有較好的抗氧化和抑菌作用，作為天然食品添加劑(抗氧化劑、防腐劑)應用于食品中。據文獻報道，多酚的提取方法主要使用溶劑萃取法、閃式提取法、生物酶解提取法、樹脂吸附提取法、超臨界提取法、超聲波輔助提取方法等[4-8]，這些方法中，超聲波輔助提取方法由于操作簡便、時間短、提取率高等特點而被廣泛用于植物多酚的提取，即在一定溫度下超聲波機械震動，使細胞壁破碎，內容物流出，與提取劑充分接觸發生反應[9]。提取工藝條件的優化對于原料的最大利用起著重要的作用。本試驗采用響應面法優化海帶中多酚的提取工藝，并通過測定海帶多酚清除 DPPH 自由基及ABTS 能力，分析其抗氧化活性，旨在為海帶的綜合利用提供一定的依據。

1 材料及方法

1.1 材料、試劑與儀器

海帶：采購于晉中市榆次區田森超市，購買回來后用水將海帶洗凈并用烘箱烘干至恒重，粉粹并用不同目數的篩子篩分，收集不同粒度的顆粒備用。無水乙醇(分析純)：天津市凱通化學試劑有限公司；沒食子酸、福林酚：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

JP-040型超聲波清洗機 廣東廣州市科潔盟實驗儀器有限公司；EV-2600型紫外可見光分光光度 上海昂拉儀器有限公司；MJ-BL35F31攪拌機 美的生活電器制造有限公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 海帶多酚的提取及多酚含量的測定[10]

稱取1 g海帶粉末于小燒杯中，加入乙醇進行超聲處理，結束后取出燒杯，對超聲后的液體進行抽濾處理，得清液。取1 mL清液，滴入3 mL福林酚并混勻，5 min后再滴入6 mL 7.5% NaCO3混勻，定容至25 mL，室溫下，暗處放置2 h，于760 nm波長下測定吸光值。以沒食子酸味為標準品得出標準曲線方程為：y=0.1815x+0.05(R2=0.9908)，進而可得多酚質量濃度，代入下式即可計算出多酚的提取率。

1.2.2 單因素試驗1.2.2.1 物料粒度

稱取不同粒度(10，30，50，70，90目)海帶粉末1 g，加入25 mL 70%的乙醇，在50 ℃下超聲30 min，考察物料粒度對多酚提取率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度

稱取1.2.2.1確定粒度的海帶粉末1 g，加入25 mL不同濃度(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇，在50 ℃下超聲30 min，考察不同乙醇濃度對多酚提取率的影響。

1.2.2.3 料液比

稱取1.2.2.1確定粒度的海帶粉末1 g，加入1.2.2.2確定濃度的不同體積分數(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)的乙醇，在50 ℃下超聲30 min，考察料液比對多酚提取率的影響。

1.2.2.4 溫度

稱取1.2.2.1確定粒度的海帶粉末1 g，加入1.2.2.2確定濃度的乙醇，按照1.2.2.3確定的料液比加入乙醇，在不同溫度(30，40，50，60，70 ℃)下超聲30 min，考察溫度對多酚提取率的影響。

1.2.2.5 提取時間

稱取1.2.2.1確定粒度的海帶粉末1 g，加入確定濃度的乙醇，按照1.2.2.3確定的料液比加入乙醇，在1.2.2.4確定的溫度下，考察不同超聲時間(10，20，30，40，50 min)對多酚提取率的影響。

1.2.3 中心組合試驗設計

通過對單因素試驗的結果進行分析，選取超聲溫度、料液比、超聲時間、乙醇濃度4個因子為自變量，以海帶多酚提取率作響應值，采用Box-Behnken中心組合設計做四因素三水平的響應面分析，用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據分析和作圖。試驗因素與水平表見表1。

表1 中心組合試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of central combination test design

1.2.4 海帶多酚對DPPH自由基清除作用

參照文獻[11,12]的方法。準確移取 0.2 mL 樣品液于試管中，加入 2.8 mL 0.05 mg/mL DPPH，充分混勻，37 ℃水浴靜置 30 min 后測定 517 nm下吸光度 A1(以無水乙醇為參比)；同時測定 DPPH 溶液與無水乙醇混合后的吸光度 A0，以及樣液與無水乙醇混合后的吸光度 A2。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

1.2.5 海帶多酚對ABTS清除作用

參照文獻[13,14]的方法。將7 mmol/L的ABTS溶液5 mL與140 mmol/L的過硫酸鉀 88 μL混合，制備ABTS+自由基儲備液，避光反應 24 h，使用前用無水乙醇將儲備液稀釋至吸光度0.70±0.02(734 nm)，即得ABTS+·稀釋液。取4.8 mL ABTS+·稀釋液與 0.2 mL 稀釋至適當濃度的樣品溶液混勻，室溫避光反應 15 min，以無水乙醇作參比在 734 nm 波長處測定吸光度 Ai；以等體積的無水乙醇代替樣品溶液，同法操作，測定吸光度 A0；以等體積的無水乙醇溶液代替 ABTS+·溶液，同法操作，測定吸光度 Ai0。

ABTS+·清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100。

1.2.6 數據處理

試驗數據取3次重復的平均值。采用Design-Expert 8.0.6、SPSS 19.0 及Excel軟件進行數據的方差分析及顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

按照單因素試驗設計開展不同因素(物料粒度、乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時間)對海帶多酚提取率的影響研究，結果見圖1(a～e)。

圖1 各因素對海帶多酚提取率的影響Fig.1 Effects of each factor on the extraction rate of kelp polyphenols

由圖1中a可知，隨著海帶粉碎粒度的加大，多酚提取率呈不斷上升趨勢，在70目時達到最大值，然而超過70目后海帶多酚的提取率逐漸減小。這說明物料粒度對多酚提取率會造成一定的影響，粒度越大，粉碎不徹底，不能將細胞破碎，內容物相對溶出的量較少而使提取率較低，粒度越小，顆粒越細，超聲時細胞越容易破碎，與溶劑接觸的相對表面積就越大，從而使多酚的提取率增高，但并不是粒度越細提取率越好，粒度過細會造成結塊現象，同時還會給后續的抽濾帶來一定的影響。因此，物料粒度70目為最佳值。

由圖1中b可知，海帶多酚提取率隨乙醇濃度的增大而呈現先升高后降低的趨勢，由于乙醇濃度的增加，導致溶液極性增強，符合相似相溶原理，之后可能由于其余化學物質的溶出，抑制了多酚類物質的溶解而使提取率減少[15]。因此，乙醇濃度70%為最佳值。

由圖1中c可知，隨著料液比的增大，海帶多酚的提取率不斷升高，當料液比大于1∶25以后，乙醇濃度的增加并沒有使多酚的提取率持續上升而是趨于平穩狀態，說明得到的多酚溶液已經趨于飽和狀態，繼續增加溶劑的體積可能會導致多糖等物質溶出[16]，并且給后期溶劑的處理與回收帶來一定的負擔。因此，料液比1∶25為最佳值。

由圖1中d可知，隨著超聲溫度的提高，在30～60 ℃之間，多酚提取率逐漸增大，在60 ℃海帶多酚提取率達最大值，之后明顯下降，可能是高溫使得多酚類化合物的化學結構被破壞[17]，而使多酚提取率下降。因此，超聲溫度60 ℃為最佳值。

由圖1中e可知，海帶多酚提取率隨著時間延長逐漸增大，在40 min時達最大值，提取時間變長，多酚可充分地溶出，使得提取率升高；當超過某一時間，多酚的提取率有所下降，可能與長時間超聲作用使得海帶中其他物質抑制多酚的溶出，使多酚提取率變低。因此，超聲時間40 min為最佳值。

2.2 Box-Behnken試驗結果

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件進行數據擬合，根據表 1設計的自變量因素超聲溫度(A)、料液比(B)、超聲時間(C)、乙醇濃度(D)與海帶多酚提取率的提取工藝參數回歸模型組合，對表2 中數據進行二次回歸擬合，建立提取工藝參數回歸模型。回歸方程為：Y=2.11+0.092A+0.14B+0.23C+0.14D+8.05×10-3AB-0.054AC-0.14AD-0.12BC+0.071BD-0.059CD-0.22A2-0.25B2-0.28C2-0.23D2，方差分析及顯著性檢驗結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression equations

注：當P<0.05時，表示差異顯著，用“*”表示；當P<0.01時，表示差異極顯著，用“**”表示。

由方差分析結果可知，回歸模型P<0.0001，表明該模型極顯著，失擬項P為0.6728>0.1，不顯著，表明模型與試驗擬合度較好，回歸模型的決定系數為R2=0.9289，校正系數RAdj2=0.8578，說明該模型誤差較小，可視為允許誤差，能夠對92.89%的響應值變化進行有效合理解釋，模型的可信度高。因此，可用此方程模型確定超聲輔助乙醇提取海帶多酚工藝參數的分析和預測。

由方差顯著性檢測分析可知，B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.01，說明它們對海帶多酚的提取率有顯著影響，A及交互項AD、BC的P<0.05，說明它們之間差異顯著。由F值大小可知，4個因素中對海帶多酚提取率的影響為C>D>B>A。

通過Design-Expert 8.0.6軟件做出各因素之間交互作用的響應面曲線圖和等高線圖，用來反映各組以海帶多酚提取率為響應值的趨勢圖，見圖 2(a～f)。響應面圖中響應面坡度的陡峭程度及等高線的稀疏程度可直觀反映出試驗因素兩兩交互作用的顯著程度，越陡峭說明響應值對操作條件的改變越敏感[18,19]，等高線呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著，呈圓形時則表示兩因素交互作用不顯著。

圖2 各因素交互作用對海帶多酚提取率影響的響應曲面和等高線圖Fig.2 Responsive surfaces and contours of the interaction of various factors on the extraction rate of kelp polyphenols

由圖2中c可知，響應面圖較陡峭，說明兩因素交互作用顯著，當溫度固定時，隨著乙醇濃度的增大，海帶多酚的提取率呈逐漸升高的趨勢，說明適當加大乙醇濃度有利于多酚物質的溶出；當乙醇濃度固定時，適當提高提取溫度可加快海帶多酚的溶出速度，等高線中乙醇濃度曲線變化密集程度高，說明乙醇濃度比溫度對多酚提取率的影響大。由圖2中d可知，提取時間曲面變化比較陡峭，同時等高線中的曲線變化密集程度高，因此，提取時間比料液比對多酚提取率的影響大。由圖2中a可知，料液比較溫度的曲線密集，說明料液比對多酚提取率的影響大。由圖2中b可知，提取時間較溫度多酚提取率的影響大。由圖2中e可知，乙醇濃度較料液比對多酚提取率的影響大。由圖2中f可知，提取時間較乙醇濃度對多酚提取率的影響大。

應用軟件分析得出用乙醇作提取劑，超聲輔助提取海藻多酚的最佳工藝條件為：超聲溫度64.18 ℃、料液比1∶27.5(g/mL)、超聲時間43.9 min，乙醇濃度73.7%，此條件下海帶多酚提取率預測值為2.139 mg/g。考慮實際操作的方便性，對這些參數稍作調整，確定超聲溫度65.0 ℃、料液比1∶28、超聲時間45 min，乙醇濃度75%，對最佳工藝條件進行平行驗證試驗，測得海帶多酚提取率為2.118 mg/g，與理論預測值接近，說明響應面優化結果可信。

2.3 海帶多酚抗氧化活性

2.3.1 海帶多酚對 DPPH 自由基清除作用

多酚物質是具有抗氧化、抗衰老等功效的一種重要的生物活性物質，其活性大小與多酚含量密切相關，DPPH自由基清除率是反映其活性的重要指標。以不同濃度的Vc溶液對DPPH自由基、ABTS的清除率為對照，研究不同濃度下海帶多酚清除DPPH自由基及ABTS的變化規律，結果見圖3。

圖3 海帶多酚及Vc對DPPH和ABTS自由基清除率的影響Fig.3 The effect of kelp polyphenols and Vc on the scavenging rates of DPPH and ABTS free radicals

海帶多酚對DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而升高，至180 μg/mL時，達最大值68.87%，在0～180 μg/mL之間，多酚濃度對DPPH清除率擬合線性方程為y=8.7836x+12.57，相關系數R2=0.9822，通過擬合方程算出清除率的IC50=81.119 μg/mL。

2.3.2 海帶多酚對ABTS清除作用

由圖3 可知，隨著海帶多酚濃度的增大，對ABTS自由基清除率呈上升趨勢，兩者之間表現出較好的量效關系，在210 μg/mL時ABTS清除率最大，為49.73%，在0～210 μg/mL范圍內，海帶多酚濃度對ABTS清除率擬合線性方程為y=5.573x+7.7579，相關系數R2=0.9867，通過擬合方程算出清除率的IC50=222.224 μg/mL，可見海帶多酚具有一定的ABTS清除能力。

3 結論

本試驗以海帶為研究試材，探究了影響超聲提取海帶多酚的因素，在單因素的基礎上采用響應面法優化海帶多酚提取工藝，并確定最佳工藝條件為：超聲溫度65.0 ℃、料液比1∶28(g/mL)、超聲時間45 min，乙醇濃度75%，在此條件下海帶多酚提取率為2.118 mg/g，接近模型預測值2.139 mg/g。通過測定海帶多酚對 DPPH 自由基和ABTS的清除率可知，其清除能力與多酚濃度之間呈一定的正相關關系，清除率分別為68.87%和49.73%，相應的IC50為81.119 μg/mL和222.224 μg/mL，由此可知，海帶多酚具有一定的體外抗氧化能力，陳浩南等的研究也發現，高良姜水提物中多酚含量較高，具有較好的ABTS和DPPH 自由基清除能力[20]。