疑似登革熱疫情標本檢測方法分析

陸鴻燕 農皓 唐安達

摘要：登革熱是一種主要分布在熱帶和亞熱帶地區的急性蟲媒傳染病，傳染性極強。因此，快速準確的對登革熱疑似病例進行有效的檢測在疫情監測和防控工作中至關重要。本文就登革熱病原學、血清學檢測方法優缺點進行分析，以期為指導臨床快速、準確、有效地檢測登革熱，提高登革熱的檢出率，避免出現誤診、漏診及延診。

關鍵詞：登革熱;標本;檢測

Abstract：Dengue fever is an acute vector-borne infectious disease mainly distributed in tropical and subtropical regions， and is highly contagious. Therefore， rapid and accurate detection of suspected cases of dengue fever is very important in epidemic surveillance and prevention. This article analyzes the advantages and disadvantages of dengue fever etiology and serological detection methods， with a view to guiding clinical rapid， accurate and effective detection of dengue fever， improving the detection rate of dengue fever， and avoiding misdiagnosis， missed diagnosis and extended diagnosis.

Key words：Dengue fever;Specimens;Detection

登革熱（dengue fever）是一種主要分布在的熱帶和亞熱帶地區的急性蟲媒傳染病，主要傳播媒介為埃及伊蚊和白紋伊蚊。被具有傳染性的伊蚊叮咬后，3～14 d出現癥狀，在登革熱高度易感地區，單個輸入的病例便可引發流行[1]。根據世界衛生組織的公布，在過去50年中，登革熱的發病率增加了30倍[2]。目前估計每年在100多個國家發生高達5000萬至1億人感染登革熱[3]，還有約3億不表現癥狀的隱性感染者[4]，因此登革熱被WHO列入2019年世界健康十大威脅之一。如何快速準確的對登革熱疑似病例進行有效的檢測，這在疫情的監測和防控工作中至關重要。本文就登革熱病原學、血清學檢測方法優缺點進行綜述，為登革熱的科學防控提供幫助。

1病原學檢測

1.1登革病毒分離培養? 登革病毒感染檢測的金標準是病毒分離培養方法，主要包括乳鼠腦內接種法、細胞培養法和蚊蟲接種法。在實踐中由于C6/36白紋伊蚊細胞對登革病毒十分敏感，登革病毒培養分離多采用C6/36白紋伊蚊細胞進行培養，根據細胞病變現象，應用間接免疫熒光試驗進行檢測。這種方法不但能確診登革病毒感染，而且還能鑒別出不同的血清型[5]。通常登革病毒感染者發熱的2～5 d為病毒血癥期，如發病4～5 d后再進行C6/36細胞培養分離登革病毒則一般需要5～10 d[6]，無法實現早期快速診斷的目的，容易造成延診。另外，該實驗方法對樣本的收集、冷藏、運輸的過程要求嚴格，對實驗人員的操作水平及相關儀器設備要求也都較高，故而該方法并不是十分適合疫情類標本的檢測，同時其靈敏度僅為40.5%[7]，因此臨床檢測中通常采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）等快速診斷方法代替它。

1.2 RT-PCR技術檢測登革病毒RNA及型別鑒定? PCR技術是利用雙鏈DNA分子堿基配對原則，在一定條件下擴增DNA片段的體外擴增方法。登革病毒含RNA基因組，因此PCR前需經過逆轉錄酶作用，合成第一條cDNA鏈（RT），再進行擴增（PCR），即RT-PCR。設計一對通用引物可擴增登革病毒組基因，在設計不同型登革病毒的引物對時，可擴增出不同的血清型病毒的基因產物。根據基因擴增產物的片段大小可判斷是否是登革病毒甚至判定出某一型的登革病毒[8]。RT-PCR是一種敏感性高、特異性強、重復性好的檢測方法。在登革病毒感染的早期，可以用這種方法對登革病毒進行早期檢測以及登革病毒型別的鑒定，這對分析登革病毒的傳播、變異有重要的意義[9]，是目前快速診斷登革熱的最好方法之一。RT-PCR 能夠直接檢測病原體的靶核酸，是病毒物質快速檢測的重要工具[10]，它可定性或定量檢測登革熱病人早期血清中的登革病毒，與其他檢測方法相比，其可以提前 5～8 d 檢測出患者在窗口期的感染情況。另外，該方法操作簡單、能進行分型，在登革病毒感染后的10 d內均可采用，具有比病毒分離法更好的靈敏度（48.4%～98.2%），對同一患者的不同標本進行檢測時，全血檢測的敏感度為90.0%，但血清或血漿檢測的敏感度相對較低為62.0%[11，12]。Waggoner JJ等[13]研究報道，采用一對通用引物從血清樣品中擴增出登革熱病毒，RT-PCR檢出率為97.0%，敏感性及特異性分別為91.4%和95.4%。

登革熱血癥期較短，對患者急性期樣本進行核酸檢測時，發病1～5 d 的登革熱核酸陽性率為75%～100%[14]，進入恢復期（發病6～10 d）的病毒核酸陽性率則快速降低，5 d后采集的血液標本中登革熱核酸檢出率低于45.8%[15]，8 d后檢出率20%左右[16]。雖然部分患者在第10天仍然可以檢出核酸，這可能是這部分患者自身免疫力較差或伴有基礎病變，影響了病毒的及時清除，導致體內病毒血癥持續時間延長[17]。此外，RT-PCR檢測結果不能判斷所檢測的標本是否為二次登革病毒感染的標本，該法要求的檢測技術含量高，費用昂貴，并不適合基層實驗室采用，而且在實際操作中影響檢測結果的因素也比較多，如樣本收集、處理、運送以及保存質量均會影響檢測結果的準確性;樣本在提取過程中操作不當容易交叉污染，造成假陽性的檢測結果;陽性對照和擴增產物的泄漏，也會導致假陽性結果;試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現的假陰性或定量檢測不準確的結果。

2血清學檢測

2.1登革病毒NS1抗原檢測? 登革病毒NS1抗原檢測采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附實驗（該法臨床考核樣品靈敏度100.00%，特異性98.79%），利用包被登革病毒抗體的板條與樣品中的登革病毒NS1抗原結合，再加入酶標試劑進行第二次溫育，當樣品中存在登革病毒NS1抗原時將形成“包被抗體-抗原-酶標抗體”復合物，加入顯色劑后，復合物上連接的HRP催化顯色劑反應，生成藍色產物，終止反應后，則變為黃色。如樣品中無登革病毒NS1抗原時則為陰性不顯色，但此陰性并不排除登革病毒感染的可能，必須結合臨床信息進行分析，它不能作為臨床診斷的唯一依據。

NS1抗原是登革病毒的一種非結構糖蛋白，大量存在于感染細胞的表面，可作為早期登革病毒感染的標志性抗原。人感染了登革病毒后，經過3～15d（通常5～8 d）的潛伏期后，臨床表現主要為“三聯癥”：發熱、皮疹、疼痛，抗體反應會因宿主的免疫差異而異。首次感染登革病毒的病例會產生最初的反應，其特征是特異性抗體的緩慢上升，發病第1天開始，血漿內就出現特異性NS1抗原，且早于IgM抗體[18]。酶聯免疫法檢測登革病毒NS1抗原無論是初次感染還是二次感染，在發病的9 d內均可以檢測，個別可以持續到18 d。2～5 d內患者NS1抗原達到峰值，5 d后逐漸下降。該檢測方法適用于登革病毒感染急性期的檢測。據Huang CH等[14]對確診患者急性期樣本檢測的報道，酶聯免疫法檢測登革病毒NS1抗原，陽性檢出率達68.37%，PCR檢測陽性率為71.94%，證實了酶聯免疫法檢測NS1抗原可用于登革病毒感染急性期的檢測。

2.2登革病毒IgM抗體檢測? 根據抗原抗體特異性結合的原理，檢測血清中的IgM抗體，顯色程度和特異性IgM 抗體含量呈正比。IgM抗體陽性，表示患者新近感染登革病毒，適用于登革病毒早期診斷。有研究表明此法檢測敏感性為 61.5%～99.0%，特異性可達79.9%～97.8%，敏感性和特異性與樣本采集時間直接相關[19]。登革病毒IgM抗體在感染后3～5 d即可出現，1～2周可以上升到抗體最高數值，之后抗體水平程下降趨勢，2～3個月內消失。首次感染登革病毒的患者，IgM 抗體升高明顯，大約50%的病例在發病3～5 d后可以檢測到登革熱IgM抗體，5 d后80%的病例可以檢測到IgM抗體，10 d后99%的病例可以檢測到IgM抗體。研究表明，采血時間對登革病毒IgM抗體的檢出率有較大影響。另外，登革病毒二次感染者IgM抗體水平遠低于初次感染，約20%～30%的患者在二次感染登革病毒后10 d未能檢測到IgM抗體。

2.3登革病毒IgG抗體檢測? 根據抗原抗體特異性結合的原理，顯色的程度與特異性IgG抗體含量呈正比，檢測血清中的登革病毒IgG抗體也可用于登革熱的篩查。研究顯示，登革病毒IgG抗體檢測的靈敏度為95.93%，特異度為 96.86%。IgG抗體在發病1周后可檢測出最低數值，通常發病10 d后可以檢測到;在此之后，IgG抗體滴度會緩慢上升，IgG抗體可維持數年甚至持續終生。若患者在發病1周內血清中檢出較高數值的特異性IgG抗體，提示可能是登革病毒的二次感染或是曾感染過其他病毒。IgG 抗體的檢測不僅可以對初次感染登革病毒的患者進行確診，也可以對二次感染患者進行判斷。二次感染登革病毒的患者，發病后1～2 d IgG抗體可迅速上升到遠遠高于初次感染的水平，故可以通過檢測登革病毒 IgG 抗體對二次感染的患者進行診斷，并根據抗體滴度高低對近期感染或繼往感染進行判斷。

3初次感染和二次感染的判斷

初次感染和二次感染的判斷依據：對于發病<7d的標本，IgM抗體陽性而IgG抗體陰性則判斷為初次感染，IgM和IgG抗體都為陽性或IgM抗體陰性而IgG抗體陽性同時登革病毒核酸檢測陽性則判斷為二次感染。而發病≥7 d的標本，IgM抗體陽性而IgG抗體陰性或IgM和IgG抗體同時陽性但IgM/IgG比值>1.2的則判斷為初次感染，IgM和IgG抗體同時陽性但IgM/IgG比值小于1.2的則判斷為二次感染[20]。

4聯合檢測

疑似登革熱病例疫情標本，根據病例流行病學調查情況，檢測登革病毒核酸和抗體IgM：病例發病日期5 d內采集的血液標本若核酸檢測結果為陰性，則再測特異性抗原NS1，若特異性抗原NS1結果還是陰性，但患者臨床癥狀典型（包括重癥）則必須再進行抗體IgG檢測。病例發病日期>5 d采集的血清標本則測抗體IgG。采用聯合檢測方法判斷結果，以任意一種檢測方法結果陽性則判定為聯合檢測結果陽性。聯合檢測可以提高登革熱陽性檢出率[21]。據楊笑涵等[22]報道，在感染登革病毒早中期，核酸聯合特異性NS1抗原檢測以及后期特異性IgM抗體聯合IgG抗體檢測的檢出率可以達到100%。

5總結

血清學檢測和核酸檢測是目前實驗室常用的快速、簡便、特異的登革熱檢測方法。這兩類方法常用于登革熱監測和登革熱疫情標本檢測。由于這兩類方法的敏感性和特異性與樣本采集時間直接相關，加之患者的個體差異，以及每種檢測方法都有最低檢測限，所以登革熱存在一定的漏診問題。血清學檢測不能區別登革血清型，但可以判斷是否感染登革病毒和初步判斷登革病毒感染的時間以及是否為二次感染。核酸檢測可確定登革熱血清型，但難以判斷登革病毒感染的時間以及是否為二次感染。由于登革熱臨床表現的復雜性和病例身體免疫狀況的差異以及每種檢測方法的局限性，應將聯合檢測方法中任意一種檢測方法檢出陽性的標本判定為聯合檢測陽性。聯合檢測方法提高了登革病毒檢出率，解決了現在登革病毒存在的易誤診、延診、漏診的問題，為處置登革熱疫情贏得時間。同時根據檢測結果來初步判斷登革病毒感染的時間以及是否為二次感染，為醫療工作者對患者采取登革病毒治療的方案作出重要的參考。

綜上所述，對疑似登革熱病例疫情標本，應根據病例流行病學調查情況，選擇恰當的檢測方法，必要時可采用聯合檢測方法，以便快速、準確、有效的檢測登革熱病毒，提高檢出率，避免誤診、漏診、延診，做好登革熱監測及疫情防控工作。

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編輯/王朵梅