徐州地區(qū)HBV感染者逆轉(zhuǎn)錄聚合酶區(qū)基因耐藥變異特點(diǎn)及耐藥影響因素分析

李 莎， 彭華彬， 李淑芹， 周 靜， 汪莉萍

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染性疾病科， 江蘇 徐州 221002

HBV感染是一個(gè)重要的全球性問題，是導(dǎo)致乙型肝炎肝硬化(LC)和肝細(xì)胞癌(HCC)的主要原因[1]。長(zhǎng)期使用核苷(酸)類藥物(NAs)可通過抑制HBV復(fù)制來降低此類疾病的發(fā)生[2]。然而，NAs很少能實(shí)現(xiàn)慢性HBV感染的功能性治愈[3][即：停止治療后仍保持HBsAg陰性(伴或不伴抗-HBs出現(xiàn))、HBV DNA檢測(cè)不到、肝臟生物化學(xué)指標(biāo)正常、肝臟組織病變改善]，大多數(shù)患者需終生服用NAs，其治療的最大障礙是不能根治乙型肝炎和易產(chǎn)生病毒耐藥。NAs治療失敗與HBV DNA逆轉(zhuǎn)錄聚合酶(reverse transcription polymerase，RT)區(qū)域的突變有關(guān)。HBV基因型耐藥突變分為兩種類型[4]：原發(fā)耐藥變異和補(bǔ)償變異，前者包括RT區(qū)中的rtA181V/T、rtM204I/V/S、rtN236T和rtM250V/L等相關(guān)突變，是導(dǎo)致NAs治療敏感性降低的主要原因。后者包括RT區(qū)中的rtVl73L、rtLl80M、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtV214A、rtQ215S、rtL233V和rtN238H等相關(guān)突變，可以恢復(fù)RT活性，該變異主要由原發(fā)耐藥變異引起。因此，HBV的復(fù)制潛力[5]可以通過補(bǔ)償變異得以不斷維持。隨著NAs的廣泛應(yīng)用，耐藥突變模式變得越來越復(fù)雜，NAs新的可疑耐藥位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)。深入了解HBV感染者RT區(qū)變異特點(diǎn)和分析影響耐藥的危險(xiǎn)因素至關(guān)重要，可為國(guó)家和本地區(qū)抗病毒治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2014年5月-2019年4月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染科實(shí)驗(yàn)室行HBV RT區(qū)基因序列檢測(cè)的患者。所有病例均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新)》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)排除合并其他嗜肝病毒感染或人類免疫缺陷病毒感染者、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、血吸蟲性肝硬化、藥物性肝損傷及遺傳代謝性肝病等其他可能引起肝損傷的疾病。既往是否使用過NAs或PEG-IFNɑ不作為本研究的排除標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 病毒學(xué)與生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 血清標(biāo)志物檢測(cè)：采用美國(guó)Abbott I2000全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀定量檢測(cè)。HBsAg檢測(cè)范圍為(0.05～250)IU/ml，大于250 IU/ml時(shí)采用1∶500自動(dòng)稀釋檢測(cè)，HBeAg檢測(cè)下限為0.50 PEIU/ml，小于0.50 PEIU/ml定義為HBeAg陰性。HBV DNA檢測(cè)：采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀定量測(cè)定HBV DNA，檢測(cè)下限為 500 IU/ml。生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：采用Beckman Coulter AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。ALT、AST、GGT、ALP、Alb、TBil(正常值參考范圍分別為 9～50 U/L、15～40 U/L、10～60 U/L、42～128 U/L、40～55 g/L、0～20 μmol/L)。上述指標(biāo)均為患者行HBV RT區(qū)基因序列檢測(cè)時(shí)的同步實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1.2.2 HBV耐藥基因突變位點(diǎn)檢測(cè)及基因型檢測(cè) HBV耐藥基因突變位點(diǎn)檢測(cè)：利用ABI基因測(cè)序儀3130對(duì)HBV DNA>1.0×103拷貝/ml的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。已知拉米夫定(LAM)耐藥位點(diǎn)：rtV173L、rtL180M、rtM204I/V/S、rtV207I/L/G、rtS213T；阿德福韋酯(ADV)耐藥位點(diǎn)：rtA181V/T/S、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN/H238T/D；恩替卡韋(ETV)耐藥位點(diǎn)：rtI169M、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtM204V/I、rtM250V/L；替比夫定(LDT)耐藥位點(diǎn)：rtL180M、rtM204I/V/S；替諾福韋酯(TDF)耐藥位點(diǎn)：rtP177G、rtA194T、rtF249A、rtA181V/T、rtN236T。HBV基因型分析：采用Chromas2.0軟件對(duì)HBV DNA P基因片段核苷酸編碼氨基酸的差異和變異類型進(jìn)行分析，將測(cè)序結(jié)果與Genbank中已知的HBV不同基因型野生株序列進(jìn)行比較，從而確認(rèn)感染的HBV基因型。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究已通過徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)XYFY2020-KL081)。

2 結(jié)果

2.1 HBV耐藥突變模式分析 本研究共納入242例患者，男192例，女50例，年齡14～81歲，平均年齡44.51歲。其中118例患者有明確NAs用藥史且發(fā)生已知耐藥位點(diǎn)變異，在118例患者中共檢出35種不同的HBV耐藥突變模式，以rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S、rtL180M+rtS202G/I+rtM204I/V/S 檢出頻率多見。其中，單位點(diǎn)突變45例，雙位點(diǎn)41例，其余32例為多位點(diǎn)突變。已知耐藥位點(diǎn)變異發(fā)生在B基因型4例，C基因型114例，未發(fā)現(xiàn)其他基因型(表1)。

2.2 不同HBV基因型患者臨床特征分析 入組的242例患者中，B基因型13例，C基因型229例。其中B基因型患者ALT水平明顯高于C基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

表1 118例患者耐藥突變模式

2.3 不同HBeAg狀態(tài)患者臨床特征分析 入組的242例患者中，HBeAg陰性66例，HBeAg陽性176例。HBeAg陰性患者年齡明顯高于HBeAg陽性患者，HBV DNA、HBsAg明顯低于HBeAg陽性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。HBeAg陰性患者CHB人數(shù)所占比例低于HBeAg陽性患者，LC、HCC人數(shù)所占比例高于HBeAg陽性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HBeAg陰性患者病程、GGT水平明顯高于HBeAg陽性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表3)。

表2 HBV 感染者B、C基因型臨床特征分析

表3 HBeAg陰性、HBeAg陽性HBV 感染者臨床特征分析

2.4 影響HBV RT區(qū)耐藥變異的危險(xiǎn)因素 在242例HBV 感染者中，除118例有明確NAs用藥史且發(fā)生已知耐藥位點(diǎn)變異外，另有46例既往有明確NAs用藥史，但未發(fā)生已知耐藥位點(diǎn)變異，將這164例納入影響HBV RT區(qū)耐藥變異的危險(xiǎn)因素分析中。以患者是否耐藥為因變量，分別以性別、年齡、診斷、病史、家族史、基因型、HBeAg、HBsAg、HBV DNA、ALT、AST、GGT、ALP、Alb、TBil、用藥情況、療程、服藥情況為自變量。建立二元logistic回歸模型。結(jié)果顯示，家族史、ALT、AST、GGT、Alb、用藥情況、服藥情況在模型中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表4)。

表4 影響患者耐藥的單因素logistic回歸分析

將上述單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，GGT、用藥情況、服藥情況在模型中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表5)。GGT>60 U/L的患者發(fā)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)是GGT≤60 U/L患者的0.160倍；相對(duì)于ETV，LAM+ADV、ADV發(fā)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)分別是ETV用藥患者的0.080倍、5.493倍；相對(duì)于持續(xù)抗病毒治療，不適當(dāng)停藥患者發(fā)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)是其5.945倍。

表5 影響患者耐藥的多因素logistic回歸分析

2.5 17例預(yù)存耐藥患者的基因型及變異情況 在242例HBV 感染者中，共檢出17例臨床資料完整的預(yù)存耐藥患者，呈現(xiàn)出9種不同的耐藥變異模式，以rtS213T最多見。其中與LAM相關(guān)的耐藥變異為9例，與ADV相關(guān)的耐藥變異為6例，與二者均相關(guān)耐藥變異有2例，耐藥模式為 rtS213 T+ rtV214A。已知耐藥位點(diǎn)變異發(fā)生在B基因型2例，C基因型15例，未發(fā)現(xiàn)其他基因型(表6)。

3 討論

由于cccDNA和整合HBV DNA的持續(xù)存在，慢性HBV感染無法徹底根除，現(xiàn)有抗病毒藥物包括NAs或PEG-IFNɑ[7]，二者實(shí)現(xiàn)慢性乙型肝炎臨床治愈的作用有限。通過對(duì)HBV RT區(qū)耐藥變異特點(diǎn)及相關(guān)影響因素的深入分析，可為HBV防治策略更新、新藥研制及疫苗研發(fā)提供及時(shí)可靠的理論依據(jù)。

Zhang等[8]調(diào)查了中國(guó)華北地區(qū)行NAs治療的4055例HBV感染者，結(jié)果表明，rtM204I/V/S發(fā)生頻率最高(13.44%，545/4055)，并且在過去7年中(2010年-2016年)，rtL180M和rtA181T/V逐漸增加，而rtM204I/V/S和rtN236T在2015年之后明顯下降。同樣，Qian等[9]的研究分析也顯示rtM204I/V/S突變的發(fā)生率在接受NAs的CHB患者中最高(34.53%，48/138)。本研究的起止時(shí)間為2014年-2019年，在118例有明確NAs用藥史且發(fā)生已知耐藥位點(diǎn)變異的患者中，以rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S較為多見，與上述研究結(jié)果基本一致。我國(guó)慢性乙型肝炎患者的NAs治療中，存在很多不規(guī)范治療的情況[10],這直接導(dǎo)致ETV耐藥頻率隨著時(shí)間推移明顯增加。本實(shí)驗(yàn)中，ETV耐藥發(fā)生率高達(dá)21%(25/118),主要變異模式為rtL180M+rtS202G/I+rtM204I/V/S(7/25)、rtL180M+rtT184A/G/I/S+rtM204I/V/S(4/25)。有研究[11]表明，rtL180M+rtA181C+rtM204V在臨床中可能會(huì)引起ETV耐藥，rtA181V和(或)rtN236T可使TDF的敏感性下降3～13倍[12-13]，更嚴(yán)峻的是，有報(bào)道[14]提示rtA181T/V可能會(huì)導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。目前各大指南[15-16]均推薦ETV和TDF作為一線HBV抗病毒藥物，rtL180M和rtA181T/V的增長(zhǎng)趨勢(shì)表明二者未來將面臨的巨大挑戰(zhàn)。因此更應(yīng)該注重HBV RT區(qū)基因序列的檢測(cè)，以便更好的調(diào)整優(yōu)化治療方案。另外，本地區(qū)HBV基因型以C基因型為主，B基因型較少，這與中國(guó)北方以C基因型為主基本一致。

表6 17例患者的基因型及變異情況

本研究中，B基因型與C基因型HBV感染者僅在ALT水平存在差異，B基因型患者ALT水平明顯高于C基因型。有研究者[17]認(rèn)為HBV基因型與所致疾病臨床特征之間沒有顯著關(guān)聯(lián)，而另一項(xiàng)在肝硬化患者的研究[18]中表明B基因型患者ALT及TBil升高程度比C基因型者明顯, 提示B基因型患者的肝損傷程度較C基因型患者嚴(yán)重。本研究中B基因型患者僅有13例，明顯低于C基因型患者(229例)，若能擴(kuò)大樣本量則可使研究結(jié)果更具參考價(jià)值。本研究亦顯示，HBeAg陽性患者的HBV DNA、HBsAg、GGT水平均高于HBeAg陰性患者，與鮑騰等[19]的結(jié)果相似。這可能與HBeAg陽性患者體內(nèi)以HBV復(fù)制活躍的野生株為主，而HBeAg陰性患者以HBV前C區(qū)變異株或C區(qū)啟動(dòng)子雙變異株為主有關(guān)。此外，HBeAg陰性患者的年齡、病程、LC及HCC例數(shù)所占比例均高于HBeAg陽性患者，說明隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，HBV造成的肝損傷程度加重。

對(duì)影響耐藥的多因素logistic回歸分析分析顯示，應(yīng)用ADV治療、不適當(dāng)停藥是發(fā)生耐藥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。正常人血清中GGT主要來自肝臟，各種原因?qū)е碌母蝺?nèi)外膽汁淤積時(shí)可以顯著升高。本研究提示高GGT水平引起患者耐藥風(fēng)險(xiǎn)降低，其機(jī)制有待深入探究。胡高飛等[20]發(fā)現(xiàn)NAs不適當(dāng)停藥易誘發(fā)慢加急性肝衰竭，長(zhǎng)期規(guī)范抗病毒治療對(duì)肝硬化患者尤為重要。有學(xué)者[21]指出，病毒學(xué)突破可由耐藥和依從性低下共同導(dǎo)致。本研究表明，不適當(dāng)停藥會(huì)使患者耐藥風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，這提示了在臨床工作中，需密切關(guān)注患者治療依從性問題，確保患者已經(jīng)了解隨意停藥可能導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)。此外，現(xiàn)已不推薦低耐藥基因屏障藥物L(fēng)AM、ADV作為抗病毒藥物首選。多項(xiàng)研究[22-24]表明，HBV DNA也是影響患者是否發(fā)生耐藥的危險(xiǎn)因素，而在本實(shí)驗(yàn)中，差異卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與病例選擇、樣本量少等有關(guān)，未來尚需進(jìn)一步動(dòng)態(tài)觀察研究。在本研究中，還發(fā)現(xiàn)了17例臨床資料完整的預(yù)存耐藥患者，以C基因型、rtS213T和rtV214A耐藥模式多見，且以補(bǔ)償變異為主。

本研究尚存在一定不足，通過直接測(cè)序法檢測(cè)到的病毒種群在病毒準(zhǔn)種中通常>20%，這必定會(huì)使部分耐藥位點(diǎn)無法檢出。未來可使用更靈敏的檢測(cè)方法，如超深度焦磷酸測(cè)序法，以實(shí)現(xiàn)更高的突變檢測(cè)率。綜上，本地區(qū)HBV感染者RT區(qū)變異以C基因型、rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S多見。B基因型患者的肝損傷程度較嚴(yán)重。應(yīng)關(guān)注HBeAg陽性患者的HBsAg、HBV DNA水平。對(duì)應(yīng)用ADV治療的患者，應(yīng)高度警惕耐藥的發(fā)生，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)抗病毒治療的依從性。在NAs治療失敗的患者中，應(yīng)綜合各方因素考慮換用高效低耐藥NAs如TDF、TAF或聯(lián)合IFN治療。對(duì)是否在應(yīng)用NAs抗病毒治療之前行HBV RT區(qū)基因耐藥檢測(cè)，仍需進(jìn)一步開展大樣本、多中心研究明確。