水環境有機污染物微生物轉化的代謝調控研究

呂 穎

(北京市北運河管理處，北京 101101)

水環境有機污染物主要來源于人類活動，具體包括生活污水、畜禽養殖廢水及各類工業廢水[1]。污染水環境的主要物質有石油類、農藥、表面活性劑以及酚類等化學物質，還有一些腐殖質、多糖類等非揮發性的有機物質，這些污染物在轉化降解時會消耗水中的溶解氧，惡化水質，破壞生態平衡[2]。微生物轉化過程是通過微生物細胞修復復雜的底物結構，即使用微生物代謝過程中產生的酶，催化底物反應[3]。代謝調控可以打破微生物細胞內的自動調節機制，使其朝著人們所期望的方向發展。研究水環境有機污染物微生物轉化的代謝調控，可以更好地監測水環境中的污染物的變化，改善水質[4]。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗有機物及微生物

實驗采用居民居住區周圍的河流水源，在水源周圍設立3個不同的水樣采集點(A、B、C點)，采集點A、B、C具體位置見圖1。

圖1 水樣采集點位置

有關研究表明:真菌分裂、生長、孢子萌發都與碳濃度大小有關，在真菌中起著調節傳輸物質的作用，還會調節氨基酸的傳輸，不同的微生物體內都有特異代謝方式[5]。實驗使用長孢葡萄穗酶，將菌株接種于種子培養液中，培養3天后獲得微生物子液，再將甘油與生理鹽水調和為4∶6的比例混合均勻，將此時的混合液與微生物子液按照1∶1的比例混合于凍藏管，放在-80℃冷凍室中保存。新鮮的微生物子液放置在斜面培養基上培養3天，獲得孢子，然后將獲得的孢子置于冷凍真空干燥的環境中保存[6]。

1.2 培養基

使用直徑90mm、高15mm、容量13mL×3格的一次性微生物培養皿，為方便對比，培養基配置3種培養基溶液：斜面培養基(PSA培養基)、種子培養基(GSB培養基)以及原始發酵培養基(改良查氏培養基)。

斜面培養基：將土豆去皮，切成薄片取30g，加入70g蒸餾水，煮至土豆松軟，使用四層紗布將土豆變為泥狀，制成濃度為25g/L的土豆溶液。加入蔗糖15g/L，瓊脂20g/L，然后將整個培養基的水分補水至100mL，然后放入微波爐中加熱直至瓊脂全部溶解的狀態，斜面培養基中的溶液制作完畢，將溶液分裝到試管中[7]。

種子培養基的具體配置成分見表1。混合表1中的各成分，使用6號成分的鹽酸將培養基溶液的pH值調節至6。

表1 種子培養基配置成分濃度

原始發酵培養基的具體配置見表2。混合表2中的各成分，使用11號濃度的鹽酸將培養皿溶液的pH值調節至6。

制備好以上3種培養基，全部置于121℃條件下滅菌15min。

表2 原始發酵培養基配置各成分濃度

續表

1.3 原始培養條件

斜面培養條件：將凍庫管中的菌液均勻涂布于斜面培養基中，放置霉菌培養箱中，保持培養箱的溫度為25℃，培養6天。

種子培養條件：使用接種環在菌種斜面上刮取拇指大小的菌體，接種到種子培養基的500mL錐形瓶中，將錐形瓶放置在25℃、180r/min搖床中培養6天。

發酵培養條件：取2mL種子培養基中的液體，接種到200mL發酵培養基中，將其置于25℃、180r/min搖床中培養6天[8]。

1.4 實驗試劑及儀器

實驗試劑包括瓊脂、蔗糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、無水硫化鈣、氯化鈣、氯化鈉、氯化鈷、鹽酸、葡萄糖、氯化鉀、硫酸亞鐵、可溶性淀粉、脫脂大豆粉、細菌學蛋白胨、酵母提取物；實際代謝調控時的儀器使用霉菌培養箱[9]。

1.5 調控方法

調控前先將接種方式更改為直接接種孢子的方式，依據轉化時間，更換培養條件：將300萬個孢子接種于100mL種子培養基的500mL錐形瓶中，接種量為5%，培養26～28h。培養溫度均為25℃，轉速為180r/min。菌體在培養基內要維持生長需要的足夠的碳，搖動發酵液后，此時微生物代謝會進入TCA循環，產生大量的能量供給微生物的生命活動[10]。改變常見碳源的濃度梯度，或改變常見碳源的成分，將碳濃度設定為表3中數值。

使用表3中調控的碳源濃度，設定3種不同梯度碳源濃度，發酵期為6天，使用150mL的錐形瓶，裝取75mL混有3種不同濃度的碳源的培養液[11]。計算菌體濕重公式為

(1)

式中：W為菌體濕重；CS為培養基面積；FS為視野面積；Fn為每片計數過的視野數；V為1L水經沉淀濃縮后的體積；v為計數框體積；Pn為每片通過計算實際數出的菌類個數[12]。

菌體干重的計算公式為

(2)

式中：M為菌體干重；x，y為培養基觀測位置；t為實驗時間；C為(x,y)處t時刻碳濃度；n為pH值大小；Dx為橫向彌散系數；Dy為縱向彌散系數[13]。

1.5.1 低碳源

將發酵液搖晃均勻后，取10mL置于布氏漏斗中，同時加入100mL去離子水沖洗，真空抽濾，水分抽濾干后將濾紙置于65℃烘箱中11h,烘干，然后置于干燥器中恒重24h，稱重，計算菌體干重。

1.5.2 中碳源

取發酵液750μL于2mL的離心管中，加入750μL發酵液與甲醛1∶1萃取后的溶液，混合均勻后，使用超聲波超聲提取5min，使用1mL注射器吸取溶液上部分清液，然后使用尺寸為0.45μm的濾頭過濾，用高效液相色譜測定菌體的干濕重。

1.5.3 高碳源

高碳源調控方法使用HPLC檢測，設定檢測條件為Kromasil-C18液相色譜柱，柱溫40℃，檢測波長為260mm，流速為1mL/min，進樣量為20μL，流動相為0.1%三氟乙酸和乙腈線性梯度洗脫。設置洗脫梯度為：0.01～30.00min，45%B相；30.00～35.00min，85%B相[14]。配置不同濃度的標準溶液(10mg/L、25mg/L、55mg/L、95mg/L、125mg/L、225mg/L、325mg/L、425mg/L、525mg/L)，計算得到相峰積分，然后計算各個相峰面積，得到菌體干濕重大小。使用峰面積對碳濃度做標準曲線(回歸系數R2=0.99)，標準曲線的公式為

y=16.591x+8.9933

(3)

式中：其中回歸系數為R2=0.9998；x為時間，min[15]。

2 調控結果

2.1 低濃度調控結果

不同菌種類型會產生不同的代謝產物，而同一種菌種在產生代謝產物時，對應最佳菌體的重量也不同，調控微生物轉化時，控制3種不同濃度的碳源，統計調控6天培養基，得到的低碳濃度的菌體干濕重變化見圖2。

圖2 低濃度碳源菌體干濕重變化

由圖2可知:控制低碳源濃度為0～35000mg/L時，隨著時間的增長，菌體濕重穩步增長，在約126h時，濕重開始減小，最終維持在38～40g之間。菌體在78h時，干重開始下降，但在90h時，又恢復穩固上升的趨勢。

2.2 中濃度調控結果

維持中濃度碳源在7000～42000mg/L，隨著水分的蒸發，前幾個小時菌體生長旺盛，菌液黏稠。將通氣調至最高，補加水增強控制菌的攝氧率，增強有機污染物微生物轉化代謝過程。中濃度碳源菌體干濕重變化見圖3。

圖3 中濃度碳源菌體干濕重變化

由圖3可知:維持中濃度碳源，在96h時，菌體濕重大小發生小轉折，但依舊保持上升趨勢；而此時的菌體干重并沒有發生明顯變化，最終維持在10g左右。

2.3 高濃度調控結果

增加碳源種類，將碳源濃度保持在21000～56000mg/L的高濃度區間內，菌體在此濃度下，自體產生自行代謝，并產生大量的前體，此時的菌體干濕重量變化見圖4。

圖4 高濃度碳源菌體干濕重變化

由圖4可知:維持高濃度碳源，菌體在20h時，濕重逐漸增加，大小增長到40g。而干重保持增長，到120h時，干重大小變為20g，之后干重減小，實驗完畢后，菌體干重維持在10g左右。

3 結 論

3.1 保持低碳濃度環境

在培養基發酵后期，菌體生長緩慢，殘糖量較低。維持正常代謝過程時需要足夠的碳骨架，碳骨架會產生代謝過程的關鍵中間體FGFC3，但在低碳濃度環境下的合成能力較低，所以代謝過程在72h時，FGFC3開始積累，才可以維持正常的代謝過程，調控方式基本奏效。在124h之后，由于殘糖量過低，培養基發酵液環境內的pH值迅速升高，導致代謝所需的FGFC3無法正常產生，破壞了發酵體系。此時的菌體濕重、干重波動較大，調控效果最明顯。

3.2 保持中濃度碳環境

在20h時，逐漸產生FGFC3，沒有出現二次積累，并隨著時間的持續積累呈現出一種小幅度的波動變化。中碳濃度的調控環境，可以提供足夠的碳骨架，幫助產生更多的FGFC3。但剩下的中濃度碳源會在一段時間內，打破代謝平衡。隨著時間的增加，代謝會產生一種由正常代謝到打破正常代謝，最終又恢復正常代謝的循環過程，導致圖2中濕重不斷增加、干重基本保持不變的情況。調控效果不明顯，基本不影響水環境有機污染物微生物的轉化。

3.3 調節到高濃度碳環境

代謝過程中的酶會將鳥氨酸轉化為瓜氨酸，瓜氨酸參與到代謝過程中反應，轉換形成精氨琥珀酸，然后在酶的催化下，裂解水解后形成尿素，加快了代謝過程。所以在72h之后，殘糖量低，高濃度的碳源會合成更多的FGFC3，剩余的碳源會因為濃度過高，經干燥后增加了菌體的干重。在120h時，經過干燥后的碳會變成區別于菌體的黑色固體，去除殘余的黑色碳，得到菌體干重大小變化。因此,高濃度調控環境，代謝調控效果一般。

4 結 語

在當今蓬勃發展的社會，疏忽對環境的保護，會造成環境的污染。研究水環境有機污染物微生物轉化的代謝調控，可以更科學地治理被有機污染物污染的水環境，更加全面地研究水環境內存在的有機污染物，有助于水環境的治理，使經濟發展與環境發展相協調，實現可持續發展。