腦信號蛋白3A及其受體神經菌毛素-1在慢性肝性腦病大鼠模型中的表達及意義

阮景晟， 陳 闖， 李科志， 黃 山， 何劍波， 曾愛屏， 連 芳， 鄔國斌

1 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院 肝膽外科， 南寧 530021； 2 廣西醫科大學 基礎醫學院， 南寧 530021

肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)是由肝功能不全和(或)門體靜脈分流所引起的大腦功能障礙，表現為從輕微認知障礙到昏迷等一系列神經精神癥狀[1-2]。HE是急慢性肝病常見的并發癥，病死率較高[3]。目前HE發病機制尚未完全闡明，也無有效的防治藥物與方法。因此，建立HE動物模型對其發病機制、診斷和治療的基礎及臨床研究發揮著重要作用[4]。HE患者臨床表現出一系列的運動和認知相關的神經系統損傷癥狀，如運動能力、協調能力、運動活性等的降低[5-6]。尋找與HE發病相關的神經系統內相關蛋白的改變及作用很有探索意義[7]。Sema3A是一種分泌型蛋白，其具有影響神經發育和神經軸突導向的功能[8]。Sema3A可以通過跨膜蛋白受體神經菌毛素(neuropilins-1,NRP-1)結合形成Plex-NP復合物來誘導軸突末端的生長錐坍塌崩解來引發神經退行性疾病，但在神經系統損傷與修復中的作用尚未完全清楚[9-11]。國外已有研究[12]證明了去葡萄糖對大鼠神經皮質細胞內Sema3A及NRP-1的作用及影響。因此，本文通過建立HE大鼠模型檢測Sema3A及其受體NRP-1的表達及變化情況，初步探討Sema3A及NRP-1參與HE病理生理過程的相關機制，為相關實驗研究及HE的臨床干預提供新的思路及靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠40只，體質量200～220 g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCKK桂2014-0002，動物使用許可證號：SYXK桂2014-0003。本研究所有動物實驗均符合中國倫理委員會的相關要求。

1.1.2 藥品及試劑 乙酸銨；Sema3A兔多克隆抗體，NRP-1兔單克隆抗體，Anti-beta Actin兔多克隆抗體(美國Abcam公司，批號分別為ab23393、ab81321、ab8227)；山羊抗兔IgG(H + L)抗體(上海碧云天公司，批號A0208)；大鼠血氨Elisa試劑盒(江蘇JSBOSSEN公司，批號BS-E12304R2);大鼠ALP、ALT、AST、TAB、Alb、TBil ELISA試劑盒(江蘇酶免公司，批號分別為MM-0217R1、MM-20436R1、MM-20437R1、MM-20428R1、MM-20429R1、 MM-20439R1)； Real-time PCR試劑盒(日本Takara公司，批號：RR820A)；引物β-Actin：上游5’-CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；下游5’-AGGAA-GAGGATGCGGCAGTGG-3’；Sema3A：上游5’-TTGCTCGGGACCCTTATTGTG-3’；下游5’-CAGTGAGTCAGTGGGTCTCCATTC-3’；NRP-1：上游5’-CCCTCCTCCT-CGCAACTCCTC-3’；下游5’-CTCAAGTCGCCTGCATCCTGTC-3’。

1.1.3 儀器 SMART3.0行為學采集和分析系統(西班牙 Panlab 公司)；Axio Observer 3型倒置顯微鏡(德國 Carl Zeiss 公司)；Power/Pac300 型電泳儀，CelDoc2000型凝膠電泳成像分析儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠HE模型(C型)的制備 將40只SD大鼠按照體質量、身體狀況、活動性等均衡的原則隨機分為4組：對照組，HE 1 d、15 d、30 d組，每組10只。HE模型制備：水合氯醛大鼠腹腔麻醉后，無菌操作開腹結扎大鼠膽總管，并將兩結扎之間的膽總管切除，給予膽總管切除術后大鼠連續灌胃濃度10 %的乙酸銨2周。對照組給予開腹后縫合但不進行膽管結扎和灌胃。

1.2.2 大鼠行為學檢測 利用SMART3.0行為學采集和分析系統在曠場中分析大鼠的行為，大鼠出現自主性活動減少、嗜睡、反應遲緩、共濟失調等癥狀之一，即可診斷為HE[13]。Zimmermann法[14]對大鼠分級，0 級：正常(11 分)；Ⅰ級：反應遲緩，神經反射正常(11 分)；Ⅱ級：自主活動下降，但反射仍基本正常(10～11 分)；Ⅲ級：共濟失調(<10 分)；Ⅳ級：角膜反射消失，動物昏迷(0 分)。

1.2.3 血液生化指標及肝臟與腦組織病理學檢測 大鼠禁食12 h后水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心，取上清。檢測血清中血氨、TBA、Alb 、TBil、AST、ALT、ALP。取各組大鼠腦組織和一小塊左葉肝組織固定，包埋，切片，染色。

1.2.4 Real-time PCR檢測Sema3A及NRP-1 mRNA的表達水平 每組10只大鼠麻醉后處死，分離出大鼠腦皮質和海馬各區，加入trizol提取RNA 進行Real-time PCR反應。2﹣△△ct用以計算mRNA的表達情況。

1.2.5 免疫組化法檢測前額葉皮層、海馬各區中Sema3A/NRP-1蛋白的表達 切片脫蠟、水化、抗原修復，封閉，一抗Sema3A(1∶300)/NRP-1(1∶200)，4 ℃孵育，辣根過氧化物酶標記，DAB顯色，封片。棕褐色或棕黃色為蛋白染色陽性表達。

1.2.6 Western Blot檢測前額葉皮層及海馬CA1、CA3、DG各區組織中Sema3A/NRP-1的表達 取各組大鼠皮層、海馬CA1、CA3、DG區組織提取蛋白。SDS-PAGE電泳，封閉1 h，一抗Sema3A，NRP-1，β-actin(均1∶1000),4 ℃孵育，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，洗膜3次。Image J軟件采集條帶灰度值，取目的條帶和內參條帶灰度值比值作為相對表達量。

比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經反射、血氨水平及HE分級的比較 對照組大鼠活動正常，感覺及神經反射靈敏。造模組大鼠均出現不同程度的神經反射和自主活動的減弱。與對照組相比，隨著時間的延長(1 d、15 d、30 d)模型組在曠場中神經反射等級、HE分級、血氨均明顯升高，差異有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠神經反射評分、血氨濃度、HE分級的比較

注：與對照組比較，1)P<0.01，2)P<0.001；與HE 1 d組相比，3)P<0.001；與HE 15 d組相比，4)P<0.001。

2.2 各組大鼠血清學各生化指標檢測結果 4組間TBA、Alb 、TBil、AST、ALT、ALP比較差異均有統計學意義(P值均<0.001)，與對照組相比，模型組Alb水平隨時間的延長(1 d、15 d、30 d)明顯降低，其余指標明顯升高(P值均<0.05)(表2)。

2.3 各組大鼠肝臟和大腦皮層、海馬CA1、CA3、DG區的病理結構的比較 肝臟HE染色結果顯示：對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞正常，無腫脹、變性、壞死等明顯病理改變。模型組大鼠肝臟匯管區及小葉周邊可見纖維組織增生和炎性細胞浸潤(圖1)。對照組大鼠腦組織清晰，細胞結構完整，神經元分布均勻;海馬CA1、CA3、DG區結構清楚，染色質均勻，細胞排列整齊。模型組可見大腦皮層及海馬CA1、CA3、DG區大量神經細胞核固縮變形，染色加深，細胞排列紊亂(圖2)。

2.4 造模后各腦區Sema3A及NRP-1 mRNA表達的改變 HE組大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區Sema3A及NRP-1 mRNA表達于造模后開始上調，隨著時間的延長(1 d、15 d、30 d)明顯增加，與對照組相比差異均有統計學意義(P值均<0.001)(表 3、4)。

表2 各組大鼠血清生化學指標結果分析

注：與對照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.05。

注：a、c，對照組；b、d，HE 30 d組。

注：a、c、g、e，對照組；b、d、f、h，HE 30 d組。

2.5 大鼠各腦區Sema3A及NRP-1蛋白表達分析 免疫組化結果顯示，HE組大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區Sema3A及NRP-1呈陽性染色，Sema3A陽性染色可見于神經元胞質和軸突，以胞膜和胞質為主(圖3)；NRP-1陽性染色可見于神經元、星形膠質細胞、微血管內皮細胞，以胞質為主，偶可見于胞核(圖4)。Western Blot 結果顯示，與對照組相比, HE組Sema3A及NRP-1蛋白表達顯著上調，隨時間延長逐漸增加，差異均有統計學意義(P值均<0.001)(圖5，表5)。

3 討論

HE動物模型的制備分為A型、B型、C型等[15]。其中可能接近慢性HE形成機制的是C型動物模型，其他模型均會導致肝臟的急性損傷，造成模型動物的死亡率較高，對HE模型的病理生理機制的研究帶來困擾[16-19]。本研究采用膽管結扎和以低毒性的乙酸銨灌胃的方式制備HE模型，模型動物神經功能呈現隨時間延長的緩慢持續性受損，病理學觀察肝臟內可見膽汁淤積和炎性細胞聚集的慢性肝損傷病變，腦組織內可見大量神經元變性，局部膠質細胞的增生及尼氏體的固縮紊亂。且模型動物的死亡率很低，說明本實驗建立了較為可靠穩定的HE模型，這是進行相關分子機制研究的基礎。

Sema3A在神經系統中可以根據神經元內cGMP水平的改變而呈現雙重性的生物功能，可以作為某種化學抑制劑，抑制神經軸突生長，或作為化學激活劑，刺激樹突頂端生長[20-22]。除了神經系統以外，Sema3A在其他組織也有分布，與細胞遷徙、腫瘤生長、免疫反應及血管生成都有密切關系[23-24]。2014年Nature發表了關于神經星形膠質細胞內Sema3A的研究成果[8]，證實了阻斷Sema3A的生成，運動神經元無法形成正常的連接，并且半數的運動神經元死亡。由此推斷特定區域內神經系統Sema3A蛋白是維持控制反射動作神經回路的必要條件。近年來有研究[25-26]表明，在腦缺血梗死及脊髓損傷中，Sema3A在梗死灶及其周圍瘢痕區的大腦皮層和海馬組織中表達上調，呈現高表達狀態。與此相似的是，本研究結果顯示，大鼠HE模型中隨著時間的延長，前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區Sema3A蛋白表達明顯上調，提示HE的發生發展機制中可能與Sema3A蛋白的高表達有關。

NRP-1是一種跨膜受體，可以介導Sema3A的信號轉導[27]。Sema3A通過與跨膜蛋白受體NRP-1結合形成Plex-NP復合物，構成了Sema3A信號通路第一級水平的調節，然后通過一定途徑將信號傳遞給細胞骨架肌動蛋白，使軸突生長錐和其他細胞結構發生相應的變化[28]。NRP-1表達于神經元、星形膠質細胞、血管內皮細胞等多種細胞，可介導多種信號蛋白的轉導，與腦損傷、腦缺血、腫瘤轉移、血管生成等都有密切的關系[29]。有報道[30]顯示，Sema3A與NRP-1形成的受體復合物，會使微管蛋白磷酸化，導致微管的失穩和解聚，從而導致生長錐的崩潰及神經功能的紊亂。本研究結果顯示，大鼠HE模型建立后NRP-1逐漸上調。結合上述結果，認為HE的發生機制可能與Sema3A/NRP-1軸的表達上調有關。

表3 大鼠各腦區Sema3AmRNA表達的改變

注：與對照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

表4 大鼠各腦區NRP-1mRNA表達的改變

注：與對照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

圖3 大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區不同時間Sema3A的表達改變(免疫組化染色，×400)

圖4 大鼠前額葉皮層和海馬CA1、CA3、DG區不同時間NRP-1的表達改變(免疫組化染色，×400)

注：a，前額葉皮層；b，海馬CA1區；c，海馬CA3區；d，海馬DG區。

表5大鼠前額葉皮層和海馬中Sema3A和NRP-1蛋白表達的定量分析

組別動物數(只)前額葉皮層Sema3A NRP-1CA1區 Sema3A NRP-1 CA3區Sema3A NRP-1DG區 Sema3A NRP-1 對照組100.11±0.020.40±0.040.51±0.040.34±0.030.44±0.03 0.23±0.03 0.22±0.02 0.42±0.03HE 1 d組100.19±0.021)0.67±0.041)0.70±0.021)0.65±0.041)0.54±0.341)0.30±0.031)0.32±0.031)0.56±0.031)HE 15 d組HE 30 d組10100.29±0.011)2)0.76±0.051)2)3)0.89±0.341)2)1.35±0.061)2)3)0.99±0.071)2)1.41±0.031)2)3)0.75±0.031)2) 0.98±0.051)2)3)0.61±0.051)2)1.00±0.071)2)3)0.53±0.031)2)0.64±0.041)2)3)0.64±0.031)2)0.86±0.041)2)3)0.72±0.041)2) 1.06±0.101)2)3)F值835.14876.59774.16472.48282.60402.36856.29207.47P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 <0.001 <0.001

注：與對照組比較，1)P<0.001；與HE 1 d組比較，2)P<0.001；與HE 15 d組比較，3)P<0.001。

目前HE的發病機制尚未完全明了，關于發病機制的主要學說有氨中毒、氧化應激、γ-氨基丁酸、錳離子、假性神經遞質、血漿氨基酸失衡等[31]。氨中毒是目前主流的認同觀點，在HE治療過程中降低血氨仍是主要的治療措施。在臨床治療過程中緩解氨中毒癥狀可以減緩HE患者的臨床昏迷癥狀。臨床前瞻性研究中血氨與認知功能障礙存在一定的劑量依賴關系[32]。而且國內外關于氨中毒對HE發病機制及其神經系統病變影響的研究已經取得了一定進展，已有研究[33]表明在大鼠慢性HE模型中，降低血氨后大鼠神經系統一系列測試和評分都有改善，降低血氨對大鼠肝功能生物標志物及一些炎癥因子、凋亡基因、神經遞質的表達都有一定影響。與此相似的是，本研究中慢性HE大鼠血氨的升高可能對Sema3A/NRP-1的表達也有一定的影響作用。

綜上所述，本研究結果顯示，Sema3A及其受體NRP-1在大鼠HE后隨著病變的進展表達逐漸上調，Sema3A/NRP-1可能參與到抑制軸突生長，阻礙神經介導，擾亂神經功能的病理生理機制中。血氨、Alb等炎性介質也可能對Sema3A/NRP-1的表達及其他基因調控機制有一定的影響。基于當前的研究進展，可對Sema3A/NRP-1神經軸進行NRP-1抑制肽、基因調控、尋找上下游靶點等進行干預。本研究尚未進行干預措施的研究，但為其相關干預的研究提供了靶點及良好的理論基礎。