膜芯片法在結核桿菌耐藥快速檢測中的應用價值

韓曉靜，林 牧，陶 雪，龔亞東，唐 竹，陳云華，馬慶慶

(貴州航天醫院中心實驗室，貴州 遵義 563000)

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculoss，MTB)感染引起的慢性傳染病[1]，已成為全球單因致死率最高的傳染病[2]。近年致死率極高的耐藥結核患者不斷增多，與早期診斷及防控的薄弱和不足等原因密切相關。目前羅氏培養+藥敏試驗是檢測MTB耐藥的金標準，但存在周期長、準確性較低、靈敏度差等缺點[3-4]，遠不能滿足臨床需要。隨著MTB耐藥分子機制研究的深入，目前已明確MTB的rpoB、inhA、katG、rpsL、embB等基因突變與結核耐藥有關[5-8]。基因芯片技術具有快速、準確率高、重復性好、通量高等特點，可應用于MTB耐藥基因的檢測[7-8]。本研究應用PCR-反向點雜交技術(膜芯片技術)對MTB與利福平(rifampicin，RFP)、異煙肼(isoniazid，INH)、鏈霉素(streptomycin，SM)和乙胺丁醇(ethambutol，EMB)耐藥相關的突變基因進行檢測，與藥敏培養比例法檢測結果進行分析對比，探討PCR-反向點雜交法(膜芯片法)在MTB耐藥快速檢測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般材料：選取2017年11月～2018年11月間在我院就診的441例菌陽性肺結核患者，其中男276例，女165例，年齡13～88歲，平均(41.25±5.56)歲。納入病例均符合中華醫學會結核病學會《肺結核診斷和治療指南》、《臨床診療手冊(結核病分冊)》、《結核病防治手冊(菌陽肺結核診斷標準)》中的診斷標準，性別、年齡隨機分布。排除標準：①合并腫瘤、高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制藥物的患者；②孕婦或哺乳期婦女；③HBV、HCV、HIV 感染者或(和)AIDS 患者。

1.2主要儀器設備：分枝桿菌核酸檢測試劑盒(北京博奧，中國)，結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法，深圳亞能)，YN-H16型恒溫雜交儀(深圳亞能)，2720 Thermal Cycler PCR儀(ABI)等。

1.3方法

1.3.1標本采集：同時采集菌陽性肺結核患者深部晨痰5 ml以上，置于2個無菌50 ml離心管中(一份進行MTB-DNA提取，另一份進行MTB培養及藥敏試驗)，密封，當日檢測。

1.3.2MTB培養及比例法藥物敏感試驗：采用羅氏培養比例法進行藥物敏感實驗，試驗方法嚴格按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》、《結核病診斷細菌學檢驗規程》操作。4種抗結核藥物的低濃度、高度濃度標準：利福平濃度為50 μg/ml、250 μg/ml，異煙肼濃度為1 μg/mL、10 μg/ml，鏈霉素濃度為10 μg/ml、100 μg/ml，乙胺丁醇濃度為5 μg/ml、50 μg/ml，只要對一種濃度耐藥即可認為該樣本對此藥物耐藥。

1.3.3痰液MTB-DNA提取及PCR擴增：痰液加入NaOH溶液搖勻液化，液化后痰液按北京博奧生物有限公司分枝桿菌核酸檢測試劑盒說明書進行MTB-DNA的提取。取4 μl上清液(MTB-DNA)于PCR管中進行PCR擴增，按深圳亞能生物技術有限公司結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒說明書的擴增條件進行擴增。

1.3.4反向點雜交及結果判讀：取檢測膜條置于15 ml離心管中，加PCR產物，雜交按深圳亞能結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒說明書進行，膜條避光顯色，出現藍色斑點即為含有相應的待檢基因，尼龍膜條芯片上探針排列見表1。

1.3.5耐藥類型定義：單耐藥：對一種抗結核藥物耐藥；多耐藥：對一種以上抗結核藥物耐藥(除同時耐利福平和異煙肼外)；耐多藥(MDR-TB)：至少對利福平和異煙肼耐藥[9]。

1.4統計數據：所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件進行處理，計數資料采用率(%)表示，以培養加藥敏法結果為金標準，應用χ2檢驗比較各組耐藥率、敏感度、特異度、準確度等指標，P< 0.05表示差異具有統計學意義。一致性檢驗用Kappa檢驗，Kappa >0.8為兩者一致性非常好；0.6

表1 膜芯片上探針位點排布圖

N1N2N3N4N5D516VD516GH526YH526DS531LS531W315N-15N43N88N306NCC315M-15M43M88M306M1306M2

注： N1～N5代表利福平rpoB基因507～533位密碼子為野生型，315N、-15N代表異煙肼katG基因第315、inhA基因第15密碼子位點為野生型，3N、88N代表鏈霉素rpsL基因第43、88密碼子位點為野生型，306N代表乙胺丁醇embB基因第306密碼子位點為野生型。D516V、D516G、H536Y、H536D、S531L、S531W代表利福平rpoB基因相應位點突變，315M、-15M代表異煙肼katG、inhA基因相應位點突變，443M、88M代表鏈霉素rpsL基因相應位點突變，306M1、306M2代表乙胺丁醇embB基因相應位點突變

2 結果

2.1四種抗結核藥物耐藥檢出情況：以培養+藥敏法測定的耐藥結果為金標準，膜芯片法對利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇耐藥檢出率、靈敏度、特異度、準確度分別見表2。441例樣本中膜芯片法檢出利福平耐藥59例(13.38%)、異煙肼耐藥69例(15.65%)、鏈霉素耐藥53例(12.02%)、乙胺丁醇耐藥28例(6.35%)。兩種方法差異無統計學意義(P>0.05)，一致性檢驗顯示Kappa均>0.7，即膜芯片法與培養+藥敏法對四種藥物耐藥的檢出一致性較好。

表2 四種抗結核藥物耐藥檢出情況(n=441)

藥物名稱膜芯片法藥敏法(例)耐藥 敏感靈敏度(%)特異度(%)準確度(%)Kappa值P值利福平耐藥55490.1698.9597.730.9040.754敏感6376異煙肼耐藥65485.5398.9097.510.8760.118敏感11361鏈霉素耐藥48582.7698.6996.600.8450.302敏感10378乙胺丁醇耐藥2177098.3096.370.7050.804敏感9404

2.2MTB耐藥類型比較：膜芯片法和培養+藥敏法檢測441例樣本，檢出總耐藥、單耐藥、多耐藥和耐多藥例數及耐藥率見表3，兩種方法差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 膜芯片法和藥敏法檢出MTB耐藥類型[例(%)，n=441]

耐藥類型膜芯片法藥敏法P值單耐藥54(12.24)59(13.38)0.994多耐藥23(5.22)26(5.90)0.991耐多藥34(7.71)35(7.94)0.998合計111(25.17)120(27.21)0.966

3 討論

目前MTB對利福平和異煙肼耐藥的分子機制相對明確，利福平耐藥相關突變主要集中在rpoB基因核心區一段長約81bp的片段上[10]，該區域突變率達95%以上[11-12]。異煙肼耐藥突變基因主要是katG和inhA基因(70%左右)[7,13-14]。鏈霉素的耐藥與編碼核糖體S12蛋白的rpsL基因和編碼16SrRNA的rrs基因突變有關[15]，耐乙胺丁醇與阿拉伯糖基轉移酶編碼基因embB基因突變有關，embB基因長約3246bp[16]，其余尚未明確。本研究所用的膜芯片探針幾乎已覆蓋利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇耐藥相關基因。

以培養+藥敏法測定的MTB耐藥結果為金標準，本研究用膜芯片法檢測利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇耐藥性的靈敏度良好、特異度極高、準確度較高，兩種方法對4種抗結核藥耐藥的檢出率差異無統計學意義(P>0.05)，且一致性較好(Kappa>0.7)，尤以利福平最高，因膜芯片覆蓋的rpoB基因探針較全(95%以上)。而MTB乙胺丁醇耐藥率、靈敏度及一致性較其他3種藥物更低，與其耐藥突變基因的相關研究并未明確有關，加之embB基因片段較長，現有膜芯片更是無法完全覆蓋。

綜上所述，與傳統的培養+藥敏試驗相比，膜芯片法應用于結核分枝桿菌耐藥基因的快速檢測具有較高敏感度、高特異度和高準確度、操作簡便、快速(僅需1 d)的優勢，因此膜芯片技術檢測結核桿菌耐藥基因可作為實驗室輔助檢查手段，對指導臨床進行有效、快速的抗結核治療，具有重要應用價值。