一株產纖維素酶細菌的發酵產酶條件優化

郭建華 張春強 郭宏文

關鍵詞：產纖維素酶細菌;FPA酶;CMC酶;發酵條件優化

能源、環境及工農業原料生產等問題越來越影響著人們的日常生活，高產纖維素酶微生物的篩選對解決這些問題都十分重要[1-3]。大多數細菌所產纖維素酶與真菌來源的酶性質不同，某些方面具有真菌酶不可替代的作用[4]。細菌纖維素酶在飼料工業、洗滌劑工業及紡織工業中具有廣泛的利用前景，因此在工業生產中的地位逐漸提高[5]，其中產纖維素酶的芽孢桿菌成為近年來的研究熱點[6]。本試驗以從白酒酒醅中選育得到的產纖維素酶細菌菌株DM-4為試驗菌株，利用單因素試驗和響應面試驗設計，優化其發酵產酶條件，為進一步的試驗研究準備條件。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

菌株DM-4，由筆者所在實驗室從白酒酒醅中選育得到，經鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

1.2 培養基

種子培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH值7.5～7.6，121 ℃下滅菌30 min。發酵培養基：CMC-Na 10 g，蛋白胨2.5 g，酵母浸出汁 1.0 g，NaCl 2.5 g，KH2PO3 0.5 g，硫酸鎂0.1 g，瓊脂10 g，去離子水500 mL，121 ℃下滅菌30 min。

1.3 纖維素酶活力測定方法

待測發酵液倒入離心管中，5 000 r/min離心 10 min，取上清液測定酶活。濾紙酶（FPA酶）活力測定：根據國際理論應用化學協會（IUPAC）的方法測定[7]。CMC酶活力測定見參考文獻[8]。

1.4 菌株液體發酵產酶條件的優化

1.4.1 發酵時間的確定 發酵培養基內接入種子后，從12 h開始，每12 h取樣測定酶活，直到72 h。

1.4.2 接種量的確定 按照1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量將種子液接入發酵培養基中，于37 ℃、搖瓶轉速200 r/min的條件下發酵36 h后測酶活力。

1.4.3 培養基成分的優化

1.4.3.1 碳源的優化 （1）碳源種類的優化：以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、麩皮（過80目篩）、玉米粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉和微晶纖維素作為唯一碳源（2%）配制培養基，接入種子后發酵36 h后測酶活力。（2）碳源濃度的優化：在優化碳源種類后，配制碳源濃度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、35%和4%的發酵培養基，接入突變菌株發酵36 h后測酶活力。

1.4.3.2 氮源的優化 （1）氮源種類的優化：優化碳源后，以蛋白胨、豆餅粉（過80目篩）、大豆蛋白粉、硫酸銨、硝酸鉀和尿素作為唯一氮源（0.5%）配制發酵培養基，接入種子后發酵36 h后測酶活力。（2）氮源濃度的優化：在優化氮源種類后，配制優化氮源濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和11%發酵培養基，接入種子后發酵36 h后測酶活力。

1.4.3.3 初始pH值的優化 分別配制pH值4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0碳氮源優化后發酵培養基，接入突變菌株發酵36 h后測酶活力。

1.4.3.4 磷酸鹽濃度優化 配制K2HPO3濃度為01%、0.5%、0.9%、1.3%和1.7%的上述條件優化后的發酵培養基，接入突變菌株發酵36 h后測酶活力。

1.4.4 響應面設計試驗 在上述優化基礎上，根據Box-Behuken設計方法，采用minitab 16構建3因素（碳源濃度、氮源濃度和磷酸鹽濃度）3水平響應面分析[9-10]。

1.4.5 統計分析 利用SPASS軟件實現統計分析及差異顯著性檢驗[11]。

2 結果與分析

2.1 發酵時間的確定

接入種子液后，從發酵12 h開始每隔12 h測定FPA酶活和CMC酶活，直到發酵后72 h，結果如圖1所示。發酵時間為36 h時，菌株產FPA酶和CMC酶都表現出了比較高的酶活力，繼續發酵到48 h會有少許增加，之后逐漸下降。經差異顯著性檢驗，發酵36 h酶活與發酵48 h酶活差異不顯著（P>0.05），而與其他發酵時間的酶活差異極顯著（P<0.01），確定36 h為最優發酵時間。

2.2 接種量的確定

不同接種量下菌株發酵產酶結果見圖2。隨接種量提高，菌株產酶活力不斷提高。接種量大于4%時，酶活提高量變小。經差異顯著性檢驗，4%、5%和6%這3種接種量條件下的酶活差異不顯著（P>0.05），綜合考查，選擇4%的接種量為優化條件。

2.3 初始pH值的優化

菌株DM-4在不同初始pH值條件下發酵產纖維素酶活力結果見圖3。試驗結果顯示，初始pH值為5.5～6.0時，菌株DM-4產酶活性最高。顯著性檢驗結果表明，初始pH值5.5條件下菌株所產酶活與初始pH值6.0條件下差異不顯著（P>005），而與其他初始pH值條件下差異極顯著（P<0.01），因此，確定最優產酶初始pH值為5.5～6.0。

2.4 培養基組分的優化

2.4.1 碳源的優化 分別利用不同碳源作為唯一碳源配制培養基進行發酵，結果見圖4。總體分析，含有纖維素物質的碳源比不含纖維素物質的碳源所產酶活高。其中以麩皮為唯一碳源時產酶能力最強，與其他碳源比較差異極顯著（P<0.01），確定麩皮為最優碳源。由圖5可知，當麩皮濃度在 2.5% 以下時，隨著麩皮濃度升高，酶活升高，超過2.5%時，酶活反而下降。在碳源濃度為2.5%時菌株所產酶活與其他濃度下所產酶活比較具有顯著性差異。碳源濃度過低會造成營養不足，能源物質少，細胞不能生成足夠的ATP滿足菌體的生長代謝，菌體生長不良，產酶活性低;而碳源濃度過高時，能源物質充足，細胞生長快，同時發酵液黏度升高，溶氧不足，使細胞產酶量下降，降低活性。在本試驗條件下選擇麩皮濃度2.5%作為優化碳源濃度。

2.4.2 氮源的優化 分別以不同物質作為唯一氮源進行發酵試驗，結果見圖6。總體而言，有機氮源產纖維酶酶活性要比無機氮源稍高。差異顯著性檢測表明，蛋白胨、豆餅粉和大豆蛋白粉作為氮源時，其酶活之間差異不顯著（P>005），而與硫酸銨、硝酸鉀和尿素作為氮源時的產酶活性差異極顯著（P<0.01）。由于試驗菌株是在酒醅中篩選出來的，經常年不斷優化，適應了有機氮源的營養，同時，有機氮源中所含的營養，除氮源外還有其他營養成分，會促進菌體產酶。綜合考慮，本試驗以蛋白胨作為最佳氮源。氮源濃度優化試驗結果（圖7）顯示，隨氮源濃度增加，菌株產酶活力增加，當氮源濃度為0.9%時，菌株產酶活力最高，氮源濃度繼續提高至1.1%后，酶活力少許下降。氮源是細胞合成產物的重要物質，數量過少，產物合成不足，數量過多，有可能造成底物抑制，細胞合成酶的數量降低，從而使菌體產酶活性降低。通過0.9%濃度時的酶活力與其他氮源濃度下的酶活力差異性比較可知，氮源濃度0.9%時，FPA酶活和CMC酶活與其他濃度下的酶活具有顯著性差異（P<0.05），因此，選擇氮源濃度為0.9%作為優化濃度。

2.4.3 磷酸鹽濃度的優化 配制磷酸鹽濃度分別為0.1%、0.5%、0.9%、1.3%和1.7%的培養基，接入菌株后進行發酵，36 h后測定纖維素酶活力，結果見圖8。當磷酸鹽（KH2PO3）濃度為 0.5% 時，菌株所產酶活最高。濃度進一步增加后，酶活反而下降。磷酸鹽濃度很小時，磷元素不足造成細胞代謝緩慢，磷酸鹽濃度過高，會引起細胞生長過快，導致營養物質只合成細胞而不產酶。顯著性檢驗表明，在磷酸鹽濃度為0.5%的條件下，與其他濃度條件下的酶活差異極顯著（P<0.01），因此，確定磷酸鹽0.5%的濃度作為優化結果。

2.3.5 響應面試驗結果 選擇碳源（麩皮）濃度、氮源（蛋白胨）濃度和磷酸鹽（KH2PO3）濃度作為培養基組分優化因子（分別為X1、X2、X3）以FPA酶（Y1）和CMC酶（Y2）活力分別作為響應值設計試驗方案。試驗因子和水平見表1，試驗方案和結果見表2。

使用mintab 16進行關于響應值與因子麩皮濃度（X1）、蛋白胨濃度（X2）和磷酸鹽濃度（X3）的二次回歸分析，去掉不顯著因素，得到二次表達式：

Y1=29.81-X3-4.267 5X21-1.872 5X22-3.52X23-1.352 5X2X3;

Y2=134.14+2.355X1-1.383 8X3-6.913 7X21-3.091 2X22-5.166 3X23-1.837 5X2X3。

方程顯著性檢驗結果如表3至表6所示，2個回歸方程都具有顯著性（R21=0.936，R22=0.949，P<0.01），失擬項不顯著（P>0.05），剔除其他項后，保留的各項系數都具有顯著性（P<0.05）。根據顯著性檢驗結果可以得知，對于菌株產FPA酶活力來說，培養基中的麩皮濃度和蛋白胨濃度在二次水平上影響FPA酶的產生，磷酸鹽濃度在一次水平和二次水平上都對FPA酶的產生具有顯著性影響，麩皮濃度和蛋白濃度之間及麩皮與磷酸鹽濃度之間不具有交互作用，而蛋白胨和磷酸鹽之間對FPA酶的產生具有交互作用。對菌株所產CMC酶來說，麩皮濃度在一次水平上也會影響CMC酶活的生產，其他與FPA酶一致，由此說明，菌株所產的CMC酶活力是FPA酶活力的重要組成部分。

利用mintab 16軟件繪出等值線圖及響應面圖（圖9、圖10）。等值線的形狀反映因素間交互作用的大小，圖形傾斜表示交互作用顯著。結合方差分析和響應面圖可知，蛋白質濃度與磷酸鹽濃度交互作用具有顯著水平，而麩皮與蛋白胨、麩皮與磷酸鹽之間的交互作用不顯著。

FPA酶優化后水平為：X1=0，X2=0.055 1，X3=-0.152 6;CMC酶優化后因子水平為：X1=0.170 3，X2=0.037 8，X3=0.141 4。考慮2種酶取因子水平平均值：X1=0.085 15，X2=0.046 45，X3=-0.005 6。對應的麩皮濃度為2.54%，蛋白胨為0.92%，磷酸鹽為0.497%（取0.50%）。在此條件下利用回歸表達式預測2種酶活力大小，FPA酶為29.78 IU/mL，CMC酶為134.29 U/mL。

2.4 優化結果驗證

根據優化結果，在麩皮濃度2.54%、蛋白胨濃度0.92%、磷酸鹽濃度0.50%、發酵初始pH值 5.5、接種量4%和發酵時間36 h的條件下對菌株進行5次產酶試驗，檢測產酶活力，并與模型預測值比較，結果如表7所示。

驗證試驗顯示，在菌株所產纖維素酶活力與模型預測值接近，差率很小（<5%），由此可確定對菌株DM-4產酶條件的優化模型是有效和可靠的。

3 結論

利用單因素試驗和響應面試驗，確定產纖維酶菌株DM-4的產酶優化條件為：發酵時間為36 h，接種量4%，培養基初始pH值5.5～6.0，培養基麩皮濃度2.54%，蛋白胨濃度0.92%，磷酸鹽濃度 0.5%。驗證試驗表明優化模型是有效和可靠的。

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