醫用羧甲基殼聚糖等電點的測定

楊永環 劉東 湯曉陽 王興媛

摘 要：本文測定了3個不同廠家的醫用羧甲基殼聚糖的等電點，驗證了《醫用羧甲基殼聚糖》（YY 0953—2015）中等電點測定方法的可行性和可靠性，最后得出結論，為標準方法的實施提供參考。

關鍵詞：羧甲基殼聚糖;等電點;醫用;測定方法

Abstract： This paper determined the isoelectric point of medical carboxymethyl chitosan from three different manufacturers， and verified the feasibility and reliability of the isoelectric point determination method in "Medical Carboxymethyl Chitosan" （YY 0953—2015）， finally drawn a conclusion to provide a reference for the implementation of standard methods.

Keywords： carboxymethyl chitosan;isoelectric point;medical;determination method

殼聚糖可由甲殼素脫乙酰化得到，是自然界中廣泛存在的堿性多糖，殼聚糖具有生物可降解性強、生物相容性好、細胞毒性低和儲量大等特征[1]。作為一種生物糖類聚合物，它是促進軟組織修復的生物材料，廣泛應用于皮膚傷口愈合、引導骨和軟骨再生以及骨關節炎的治療[2-3]。

由于殼聚糖不溶于水和有機溶劑，只溶于稀酸，因此殼聚糖的應用受到限制。羧甲基殼聚糖是殼聚糖最重要的衍生物之一，羧甲基殼聚糖相比殼聚糖有更好的生化及物理特性，并且溶解性更好，尤其是在中性和堿性溶液中，其溶解性顯著增強，使其具有成膜、增稠、保濕、螯合等特性，因而能夠廣泛應用于農業、食品、醫藥和化妝品等領域。在醫療器械行業中，目前市場上常見的產品有殼聚糖護創海綿、外用殼聚糖抗菌液、殼聚糖敷料等。羧甲基殼聚糖溶液對pH敏感，存在等電點，在試驗的過程中，人們發現，同是羧甲基殼聚糖，但不同廠家產品的等電點有很大的差異。本文詳細介紹了羧甲基殼聚糖等電點的測定，目的為驗證《醫用羧甲基殼聚糖》（YY 0953—2015）中等電點試驗方法的可行性和可靠性。

1 試驗流程

1.1 試驗樣品

試驗樣品有三種。一是醫用羧甲基殼聚糖，產自煙臺萬利醫用品有限公司;二是羧甲基殼聚糖，產自賽克賽斯生物科技股份有限公司;三是羧甲基殼聚糖，產自石家莊億生堂醫用品有限公司。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器包括：電子分析天平，梅特勒-托利多XPE205;紫外可見分光光度計，Agilent Cary 60;多參數測定儀，梅特勒-托利多;恒溫磁力攪拌器，鞏義市予華ZNCL-BS230;離心機：SIGMA 3-30K。主要試劑為鹽酸。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試液制備。分別稱取羧甲基殼聚糖0.50 g和1.00 g，將其置于兩個500 mL燒杯中，加蒸餾水300 mL，攪拌，完全溶解后轉移至500 mL容量瓶中，定容，配制成質量濃度分別為0.1%和0.2%的溶液。

1.3.2 供試液pH梯度調節。將供試液分裝在10個100 mL燒杯中，每杯為30 mL，用恒溫磁力攪拌器不斷攪拌，緩慢向其中滴加0.05 mol/L的鹽酸，用pH計連續測定溶液pH，調節每杯pH分別為5.2、5.0、4.8、4.6、4.4、4.2、4.0、3.8、3.6、3.4，然后用濾紙過濾掉不溶物或離心，以蒸餾水為空白，測定濾液250 nm處的透光率。

1.3.3 結果處理。以透光率為縱坐標，pH值為橫坐標，繪制T-pH曲線，觀察透光率發生突變的點，羧甲基殼聚糖的等電點為透光率突躍為最大的pH值。

2 檢測結果

2.1 煙臺萬利樣品數據

在不同pH的條件下，質量濃度0.1%和0.2%的樣品在250 nm處的透光率如表1所示。質量濃度為0.2%的樣品，在pH為5.2～4.6時，溶液呈透明凝膠狀，用濾紙很難過濾，在pH為4.4時，溶液流動性變好。質量濃度0.1%的樣品，在pH值為5.2～4.6時，溶液呈透明凝膠狀，用濾紙也不容易過濾，但稍好于質量濃度為0.2%的樣品。所以，用紫外分光光度計測透過率時，本研究只過濾了pH為4.4～3.4的樣品。由圖1可以看出，在0.1%和0.2%的質量濃度下，煙臺萬利樣品的透光率均在pH=3.6時發生突變，其等電點為3.6。

2.2 賽克賽斯樣品數據

在不同pH的條件下，質量濃度0.1%和0.2%的樣品在250 nm處的透光率如表2所示。不管是質量濃度為0.1%還是0.2%，在不同pH下，塞克塞斯樣品用濾紙均難過濾，所以本研究采用離心后來測不同pH條件下的透光率。由圖2可以看出，在質量濃度為0.1%和0.2%的條件下，塞克塞斯樣品的透光率均在pH=4.0時發生突變，但是與煙臺萬利樣品相比，透光率突變不是太明顯。

2.3 石家莊億生堂樣品數據

在不同pH的條件下，不同質量濃度在250 nm處的透光率如表3所示。由圖3可以看出，在0.1%和0.2%的質量濃度下，石家莊億生堂樣品的透光率均在pH=4.0時發生突變。

3 驗證結論

3.1 樣品質量濃度

在質量濃度為0.05%～0.5%時，根據三個樣品的滴定情況，筆者發現，羧甲基殼聚糖質量濃度不能太大。煙臺萬利和石家莊億生堂樣品質量濃度適宜保持在0.1%～0.3%，賽克賽斯樣品質量濃度適宜保持在0.1%～0.2%。

3.2 鹽酸的濃度

在調節pH時，筆者試驗了不同的鹽酸濃度，所用鹽酸濃度不能大于0.1 mol/L，否則滴定時形成氣泡包夾溶液，很難攪拌開，鹽酸濃度取0.05 mol/L較為合適。

3.3 過濾

調節好溶液的pH后，用濾紙過濾掉不溶物，當pH較高時，不同質量濃度溶液的過濾效果稍有差別。例如，在pH為4.2～5.2時，由于溶液較濃，濾紙很難過濾掉不溶物。

3.4 離心

調節好溶液的pH后，如果選擇離心后測透光率，那么離心轉速和離心時間對最后的試驗數據有一定影響，本研究選擇的離心條件是6 000 r/min，離心10 min。

3.5 等電點

羧甲基殼聚糖等電點不是固定的，不同廠家的樣品等電點有一定的差別。

參考文獻：

[1]Kean T，Thanou M.Biodegradation，biodistribution and toxicity of chitosan[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2010（1）：3-11.

[2]于瑪麗，李麗梅，郭家智，等.殼聚糖在組織工程的應用[J].中國高新科技，2019（3）：103-105.

[3]CHEN Z，DENG S，YUAN D C，et al.Novel nano-microspheres containing chitosan，hyaluronicacid，and chondroitin sulfate deliver growth and differentiation factor-5 plasmid for osteoarthritis gene therapy[J].Journal of Zhejiang University Science B ，2018（12）：910-923.