pho2 突變體礦質元素含量及耐鹽性分析

朱振興，李 丹，王春語，張麗霞，陸曉春

(遼寧省農業科學院作物分子改良實驗室，遼寧 沈陽 110161)

【研究意義】磷元素是植物生長發育所必須的礦質營養之一，由于磷礦是不可再生資源，在不久的將來面臨磷礦資源的枯竭[1]。然而在農業生產實踐中，施用的磷肥僅有大約1/3的肥料被當季作物所利用，其余大量肥料被浪費，這樣既不經濟，也不環保，經常造成水體污染事件發生[2]。培育磷養分高效作物，是可持續經濟發展的重要途徑之一，因此研究磷元素分子生理調控機制有重要的意義。【前人研究進展】在擬南芥和水稻中，對磷饑餓信號響應都有比較深入的研究[3-4]。其中AtPHO2是一個重要磷信號調控基因，編碼了泛素E2連接酶，通過泛素化作用降解AtPHO1蛋白，從而抑制了AtPHO1基因的功能，AtPHO1基因的主要功能是在木質部進行磷元素的轉載和輸出。在水稻中鑒定出有3個AtPHO1的同源基因，分別是OsPHO1;1，OsPHO1;2和OsPHO1;3。OsPHO1;2基因鑒定出來是在水稻中木質部進行磷元素裝載和輸出，從而將磷元素從根系轉運到地上部分[5-7]。OsPHO2還可以通過泛素化降解機制，調控PHT1蛋白在內膜上的含量，達到調控磷吸收轉運的目的[8]。另外OsPHO2轉錄本也會被miRNA399所降解，從而可以反饋抑制OsPHO2基因的表達[9]。水稻中OsPHO2基因的突變，會造成突變體植株地上部磷元素超量累積，甚至高達數倍[10]。【本研究切入點】筆者對OsPHO2基因的印象一般是只與磷有關的，但是否可能參與了其他礦質營養的調控或是否對其他礦質元素的影響，尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】本研究擬分析日本晴野生型和日本晴背景ospho2突變體，在正常種植的條件下，地上部分和種子中的礦質元素含量。離子測試的結果表明Na離子的含量在水稻和高粱pho2中都有大量累積，而Na離子的含量是植物耐鹽的重要指標之一[11-12]。本文擬開展水稻和高粱pho2突變體萌芽期耐鹽實驗。

1 材料與方法

1.1 材料種植條件

日本晴野生型WT和ospho2突變體(中科院遺傳發育所儲成才研究員提供的水稻ospho2突變體)，發芽后進行營養液水培10 d。使用木村氏培養液，大量元素MgSO4·7H2O (0.5470 mM); (NH4)2SO4(0.3650 mM); KH2PO4(0.1820 mM); KNO3(0.1830 mM); Ca(NO3)2·4H2O (0.3660 mM); 微量元素MnCl2·4H2O (0.0005 mM); H3BO3(0.0030 mM); (NH4)6Mo7O24·4H2O(0.0001 mM); ZnSO4·7H2O(0.0004 mM);CuSO4·5H2O (0.0002 mM); NaFe-EDTA·3H2O (0.0400 mM)，調節pH值到5.5。移栽于10 kg土壤均一的塑料桶中，一桶挑選2株大小一致的苗，WT和突變體各種植3桶，共6桶。在室外種植2個月左右，6-7月的沈陽，然后搬到溫室中白天30℃/12h， 晚上22℃/12h，光強約3萬lx, 濕度控制在70 %左右，直至開花結實，成熟。因水稻品種日本晴在沈陽夏季自然的室外條件下，沈陽日照時間較長，日本晴不易正常抽穗，所以進行這樣種植方式。

1.2 金屬礦質元素含量的測定

在日本晴和ospho2突變體成熟后，收取稻穗后，收獲每個樣品地上部分，先120 ℃殺青20 min，然后80 ℃，烘干至恒重約2～3 d時間。測定時每個樣品取2株長勢一致的植株，地上混合在一起，然后用機器粉碎成粉末狀。日本晴和ospho2突變體每個品種2個生物學重復，每個生物學重復包含兩株苗的均勻混合。礦質元素測定時，采用ICP-OES(Optima 8x00，PerkinElmer，USA)測定金屬元素的含量。樣品稱取0.1 g左右，加濃硝酸5 mL，0.5～1 mL H2O2，然后采用微波消解儀MARS 6.0(CEM，USA)，按照標準程序進行微波消解，最終溶液呈無色透明狀，然后通過約200 ℃高溫加熱，進行趕酸至約0.5 mL，最后定容至50 mL，其后按照儀器的操作規程進行金屬元素含量的測定。

1.3 總磷含量的測定

樣品的處理同上，稱取樣品0.1 g左右，微波消解儀硝化完后，趕酸、定容至50 mL，然后利用流動分析儀(San++System，SKALAR，Netherlands)，采用鉬酸銨顯色法測定總磷的含量。

1.4 水稻和高粱pho2突變體耐鹽性比較

高粱或是水稻干種子在10 mL離心管中，首先用5 %次氯酸鈉溶液消毒5 min，然后用滅菌水清洗洗3～4遍，然后在培養皿中鋪上兩層濾紙片，加上適量滅菌水或是1.2 %的NaCl溶液，放入30 ℃恒溫培養箱中培養，然后觀察萌芽成苗狀態。植株的表型照片使用相機進行拍攝(EOS 5D, Canon, Japan)。

1.5 數據統計分析

利用Excel2007進行數據的差異性顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 成熟期地上部日本晴野生型和ospho2突變體礦質元素含量分析

在成熟期時，盆栽中的野生型日本晴和ospho2突變體，取樣測定地上部分中的礦質元素含量，包括大量元素和微量元素。結果表明在ospho2突變體中總磷的含量超量累積，總磷的含量幾乎是野生型中的4倍(圖1-A)。不僅總磷的含量有所改變，其他元素含量也有改變。其中鉀(K)元素含量在突變體中增加了約16 %，另外Mg元素的含量也增加了47 %，Ca元素也有增加，但是統計上并不顯著(圖1-A)。在微量元素的分析上，也有含量上有顯著差異的元素。Na, Zn, Cu總的含量較野生型沒有顯著性差異，但是Fe元素的含量較野生型是顯著降低，而錳元素Mn的含量較野生型顯著增加的，增加了將近84 %的量(圖1-B)。

A. 野生型日本晴和突變體ospho2地上部大量元素磷、鉀、鎂和鈣的分析； B. 野生型日本晴和突變體ospho2地上部微量元素鈉、錳、鐵、銅和鋅的分析A. Macroelement contents of Nip and mutant ospho2; B. Microelement contents of Nip and mutant ospho2, star indicates as student’ T test, * 0.01 P<0.05, ** P < 0.01圖1 成熟期野生型日本晴和突變體ospho2地上部離子含量Fig.1 Shoot ion contents of wild-type Nip and mutant ospho2 at maturity stage

A. 野生型日本晴和突變體ospho2種子中大量元素磷、鉀、鎂和鈣的分析；B. 野生型日本晴和突變體ospho2種子中微量元素鈉、錳、鐵、銅和鋅的分析, 星號代表student’ T 檢測，* 0.01 P < 0.05，** P < 0.01A. Macroelement contents of Nip and mutant ospho2; B.Microelement contents of Nip and mutant ospho2, star indicates as student’T test, * 0.01 P < 0.05, ** P < 0.01圖2 野生型日本晴和突變體ospho2種子中離子含量Fig.2 Seed ion contents of wild-type Nip and mutant ospho2

2.2 成熟期時日本晴野生型和ospho2突變體種子中礦質元素改變情況

在盆栽條件下野生型和ospho2突變體成熟時期，我們對其種子進行礦質元素含量分析。結果表明，在種子中，總磷的含量突變體較野生型是顯著增加的，但是遠遠沒有達到在地上部分積累的程度，相對野生型種子僅增加了30.27 %；其中鉀元素的含量也有所增加，在種子中較野生型增加了92.29 %；Mg、Ca和Zn元素的含量也顯示出了顯著的增加；特別是Na元素在突變體中極顯著的增加，其他元素如Mn、Fe、Cu的含量并沒有統計上顯著的差異變化(圖2)。研究表明在ospho2的突變體中有大量的非磷元素也有累積效應，特別是金屬元素，不論是在種子中或是地上部分。

2.3 稻和高粱pho2突變體萌發期耐鹽性比較

因在水稻ospho2突變體中，Na元素的含量顯著累積(圖2)，同時在實驗室構建的高粱EMS突變體庫中[13]也篩選并克隆了高粱sbpho2突變體，在種子中Na元素的含量較野生型也是顯著增加(未發表的數據)。因Na離子含量是植株是否耐鹽的重要指標之一，為了研究是否種子中過量累積的Na元素，會影響種子萌發期的耐鹽特性，開展了鹽脅迫實驗。通過以前的預實驗，將NaCl的濃度定位1.2 %。高粱和水稻對鹽脅迫處理的反應有不同。在鹽脅迫處理下，水稻中野生型的芽苗率逐步上升，最終達到平臺期，而高粱中野生型芽苗率呈現從高峰逐漸下降的過程(圖3-A和C)。因為高粱中有些種子在鹽脅迫下盡管開始時能夠萌芽，但是隨著鹽處理天數增加會逐步死亡，而水稻的觀察是只要種子萌芽了就會逐漸生長。水稻和高粱pho2突變體在鹽處理下較野生型芽苗率明顯降低，相對芽苗率可以直觀看到這一點，特別是在高粱中(圖3-B和D)。盡管在水稻中僅鹽處理下第4天，突變體芽苗率較野生型在統計上有顯著差異。在高粱中突變體在所有的時間點，較野生型都是統計上的顯著差異。從15 d鹽脅迫表型照片，在對照條件下，高粱或是水稻pho2突變體較其野生地上部分生長狀態差不多，而在鹽脅迫條件下高粱或是水稻pho2突變體地上部分生長較野生型都有所抑制(圖3-E到H)。這些數據都表明高粱和水稻pho2降低了植株對鹽脅迫的抗性。

A、C分別顯示水稻和高粱在1.2 % NaCl處理下不同時間點的芽苗率；B、D分別顯示水稻和高粱在1.2 % NaCl處理下不同時間點的相對芽苗率；E、F代表水稻和高粱野生型和pho2突變體在0 % NaCl下處理15 d時的表型；G、H代表水稻和高粱野生型和pho2突變體在1.2 % NaCl處理15 d時的表型，星號代表student’ T 檢測，* 0.01 P < 0.05，** P < 0.01A and C：Seeds germination and seedlings survival rates of rice and sorghum plants under 1.2 % NaCl treatment;B and D: Relative seeds germination and seedlings survival rates of rice and sorghum plants under 1.2 % NaCl treatment; E and F: Phenotypes of rice and sorghum WT and mutant pho2 after 0 % NaCl 15 days treatment; G and H: Phenotypes of rice and sorghum WT and mutant pho2 after 1.2 % NaCl 15 days treatment, star indicates as student’T test, * 0.01 P<0.05, ** P<0.01圖3 水稻高粱pho2突變體耐鹽性比較Fig.3 Comparison of rice and sorghum pho2 salt resistance

3 討 論

首先簡單總結一下磷饑餓信號的傳導途徑。以水稻中的磷信號途徑為例，以OsPHR2轉錄因子為核心。在磷饑餓的條件下，OsPHR2激活下游各種PSI磷饑餓響應基因，如上調磷酸鹽轉運體基因，上調SQD或是PAP酸性磷酸酶，另外OsPHO2也會通過miRNA827或是miRNA399反饋抑制調控NLA(Nitrogenlimitationadaptation)或是OsPHO2的表達水平[14]，而OsPHO2主要作用是抑制了OsPHO1(在木質部進行磷元素的裝載和進行磷酸鹽的輸出efflux)。以及通過泛素化降解，調整了PHT1家族磷酸轉運體蛋白的含量，達到調控磷吸收的目的。同時SPX蛋白可以通過與OsPHR2蛋白的互作，反饋抑制磷的激活信號。而SPX蛋白基因可以通過結合OsPHR2對其產生抑制作用，從而抑制其對下游基因的激活作用[15]。另外IPS1/2基因可以通過與miRNA399 mimic作用，可以降解miRNA399而最終反饋調控它的表達，從而達到一個調控miRNA399的作用，這個基本上就是磷信號的調控途徑。

OsPHO2基因編碼的是一個泛素E2連接酶，在磷信號途徑中主要起負調控作用。在磷元素充足的條件下，OsPHO2通過泛素化降解了OsPHO1蛋白，而OsPHO1的功能是負責在磷元素從地下部分木質部轉運磷元素到地上部分。另外推測OsPHO2可能會對SPX gene 或是其他磷饑餓響應基因(PSIgenes)有間接的抑制作用，但是缺乏直接的證據。對OsPHO2的功能已經有很多的研究，突變后造成類似于激活了磷饑餓的信號，它在磷信號途徑中的關鍵作用，也有一定的了解，但是對其他礦質元素的影響，基本沒有太多的了解和報道。先前的報道表明在水稻ospho2突變體中，地上部總的硝態氮含量較野生型是顯著降低，可能是由于一個硝態氮轉運體以及硝酸鹽還原酶在根中的表達量降低，導致從根中向地上部分運輸量的減少。另外Fe的含量也在ospho2突變體顯著根中增加，鐵和磷的信號有一定的相互作用，在ospho2突變體中根部有顯著的鐵累積，地上部分Fe的積累并不顯著。很多Fe響應基因在突變體中表達上調了，如OsNAS1,OsNAS2,OsIRT1以及OsYSL15在突變體中的表達顯著上調了，最終促進了植株Fe元素的吸收，造成在突變體根中累積了大量的Fe元素[10, 16]。初步的研究表明，OsPHO2基因的突變不僅僅是造成磷元素的超量積累，也造成了其他礦質元素含量的改變，大部分是增加。通過對成熟期的WT日本晴和突變體ospho2，測定成熟期地上部分和種子的礦質元素的含量，研究表明在ospho2突變的情況下，在地上部分，除了磷元素大量的累積外，也發現了其他元素也累積了很多金屬元素，諸如，鉀、鎂、鐵和錳元素的含量在突變體的地上部分顯著的累積，鉀、鎂、鈣、鈉以及鋅等元素在突變體種子中，也有顯著的增加。在突變體的種子中或是地上部，礦質元素累積的趨勢都是差不多。不同的是在種子磷累積的量并沒有如地上部分累積的那么多，僅僅較野生型有30 %的增加，可能是因為磷元素從地上向種子中運輸的時候，此時沒有更多的磷相關的轉運體并沒有被OsPHO2調控的或是相關的PSI基因調控的程度并沒有較地上部分那么高。相比較而言，其他非磷元素的在突變體種子中的累積量較地上部分趨勢是差不多，可能這些元素向籽粒中運輸的相關的基因表達量較地上部分是差不多的。所以這些元素的增加，可能是由于其相關的轉運體的表達量被上調了，或是也有可能是鰲合的金屬元素的釋放增加了，造成這些元素的含量的增加。另外的可能性可能是OsPHO2可能直接或是間接調控了這些基因的表達或是蛋白的含量，最后，這些基因可能是這些金屬元素運輸的重要的轉運體。另外現在的研究也表明有些鉀高親和轉運體也可以進行一價或是二價離子的轉運，如Na, K, Cu, Zn, Mg, Ca 以及Fe等元素，也有可能是這些轉運體將其他離子帶入到植株體內[17]，是否是直接或是間接，就有待今后的研究來證明這些猜想或是產生的疑惑。初步的研究結果強烈表明OsPHO2基因可能的多樣性功能，我們的結果為將來的深入研究提供了有用的線索。

培育耐鹽作物是未來增加糧食產量重要的研究方向之一，植物體內Na離子的含量是植株耐鹽特性的重要指標之一，在大麥水稻作物中有一定的研究[11-12]。因水稻和高粱的pho2突變體種子中超量累積Na離子，進行了種子在萌芽期的耐鹽試驗。結果也表明水稻和高粱pho2突變體降低了，萌芽期對鹽的抗性。推測因pho2造成植株Na離子的增加，而間接造成了突變體對鹽脅迫的耐性下降。同時也看到了水稻和高粱在萌芽期的耐鹽特性的不同。在鹽脅迫下水稻萌芽后，一般就能逐漸長成苗，而高粱種子即使萌芽后，也有可能植株逐漸死亡。

通過本研究，發現了在ospho2突變體中有大量其他非磷金屬元素的累積，甚至在種子都有積累。但是在種子中，也積累很多其他的元素。這些非磷元素增加，是OsPHO2的直接作用，還是間接的作用，有待進一步的研究。這個深入的研究，為揭開ospho2突變體中調控其他礦質元素的作用，或是揭開磷元素和其他元素互作的機理。將來可通過表達譜或是蛋白組等技術研究在突變體中，哪些元素有關運輸相關轉運體之類的基因或是蛋白表達的差異，可能揭示這些營養元素差異的原因。或是通過最新的基因編輯技術進行基因敲除，在ospho2背景下敲除一些相關轉運基因，為探索不同基因作用機制的不同，為全面解析OsPHO2的功能提供了可能的解決辦法。

4 結 論

實驗結果表明，在水稻ospho2突變體中不僅只有磷元素的改變，其他很多非磷元素也有改變。水稻和高粱pho2突變體萌芽期對鹽脅迫的抗性下降。