甘薯等20種作物蔗糖轉化酶抑制子生物信息學分析

楊冬靜，謝逸萍，孫厚俊，張成玲,馬居奎，李宗蕓，馬代夫,*

(1．江蘇師范大學 生命科學學院，江蘇 徐州 221116；2．江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所/農業部甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇 徐州 221131)

【研究意義】隨著分子生物學技術的快速發展，采用基因工程技術進行農作物性狀的定向改良已成為現實。近年來，國內外學者也有大量關于轉基因甘薯增強抗病性以及抗逆性狀的研究和報道。【前人的研究進展】在甘薯抗病基因克隆和品種抗病性改良方面，陳觀水等[1](2007)分離到抗病基因IbNPR1；王鈺等[2](2008)從甘薯中分離抗病基因同源序列(RGA)；Kim等[3](2012)報道病原菌侵染后IbERF1和IbERF2在葉片中的表達量明顯上升，推測它們可能參與調控甘薯抗病反應；柏潔[4](2014)分離了IbSPR1和IbSGT1；Zhai等[5](2015)報道IbMIPS1不僅可提高甘薯的耐鹽和耐旱性，還能提高甘薯的抗莖線蟲病的性能。Li 等[6](2017)分離到甘薯蔓割病抗病基因IbSWEET10，并在在蔓割病敏感甘薯品種栗子香中進行IbSWEET10基因的過表達和干擾，結果表明過表達IbSWEET10基因能夠促進轉基因植株葉片中糖分的向外運輸，降低了轉基因株系中的糖含量，進而減少了病原菌生長繁殖所需的能量物質，從而顯著提高了轉基因植株對蔓割病的抗病性。【本研究切入點】蔗糖轉化酶(Invertase)是植物體內蔗糖代謝的關鍵酶，在正常生長發育條件下，蔗糖轉化酶不可逆地催化蔗糖分解為葡萄糖和果糖。越來越多的研究表明，蔗糖轉化酶可被生物和非生物脅迫因子誘導，說明了蔗糖轉化酶不僅是糖分的關鍵調節因子，也是多種逆境調控途徑中的重要成員[7-9]。而蔗糖轉化酶抑制子是轉化酶翻譯后的一個重要調控因子，通過與轉化酶互作形成復合物來調控其活性[10]。在甘薯中，本課題組前期分離得到IbINH全長開放閱讀框(ORF)，但是該基因的功能尚不清晰，是否參與甘薯抗病抗逆調控有待進一步研究。本文在此基礎上，進一步通過NCBI搜索其他作物中編碼INH蛋白質的氨基酸序列，擬采用系列生物信息學軟件對對其氨基酸序列的組成、理化性質，蛋白質磷酸化位點、跨膜結構域和信號肽預測、二級結構、蛋白質亞細胞定位以及功能結構域等進行預測和比較分析。【擬解決的關鍵問題】蛋白質功能預測和INH蛋白序列比較分析可為深入研究IbINH的功能提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 INH序列來源

本課題組前期從甘薯中克隆并測序獲得IbINH基因的全長ORF，采用在線translate tool將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列。從NCBI數據庫下載番茄等其余19種作物INH蛋白質的氨基酸序列，序列登錄號分別如下：煙草(Nicotianatabacum)，登錄號：XP_016474343；辣椒(Capsicumannuum)，登錄號：XP_016551458；番茄(Solanumlycopersicum),登錄號：AGC75063；南方菟絲子(Cuscutaaustralis)，登錄號：RAL38588；馬鈴薯(Solanumtuberosum)，登錄號：AYV96510；小果咖啡(Coffeaarabica)，登錄號：XP_027115869；向日葵(Helianthusannuus)，登錄號：XP_022000364；洋薊(Cynaracardunculusvar. scolymus)，登錄號：XP_024985897；黃花蒿(Artemisiaannua)，登錄號：PWA72117；芝麻(Sesamumindicum)，登錄號：XP_011096732；茶樹(Camelliasinensis)，登錄號：XP_028100701；黃猴花(Erythrantheguttata)，登錄號：XP_012827426；粉紅鐘花(Handroanthusimpetiginosus)，登錄號：PIN23254；糙葉山黃麻(Parasponiaandersonii)，登錄號：PON64913；蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，登錄號：XP_003609825；葡萄(Vitisvinifera)，登錄號：RVW26474；蓖麻(Ricinuscommunis)，登錄號：XP_002519258；橙子(Citrussinensis)，登錄號：XP_006488813；山荊子(Malusbaccata)，登錄號：TQE03219。

1.2 序列分析方法

利用在線軟件ProtParam分析INH編碼的氨基酸殘基數目、氨基酸組成、相對分子量、理論等電點等理化性質；采用NetPhos 3.1server進行INH蛋白質磷酸化位點預測；采用Protscale對INH蛋白質親水性或疏水性預測；采用SOPMA對INH蛋白質二級結構進行預測；采用TMHMM進行INH蛋白質跨膜結構域的預測；INH蛋白質信號肽采用Signal3.0軟件進行預測；利用WoLF PROST對INH蛋白質亞細胞定位進行預測；NCBI在線對INH蛋白質序列保守結構域進行預測。

2 結果與分析

2.1 INH的氨基酸組成以及理化性質的預測分析

通過在線軟件Physicochemical Property ProtParam分析甘薯等20種作物中INH蛋白質氨基酸殘基數目、理論等電點、相對分子量、氨基酸組成及高含量氨基酸所占比例以及蛋白質穩定性和疏水性/親水性，結果如表1所示，20種INH蛋白質的氨基酸殘基數目介于147～193，相對分子量介于15 324.10～21 374.97。參試INH蛋白質中，甘薯、煙草、辣椒、番茄、南方菟絲子、馬鈴薯、芝麻、黃猴花、糙葉山黃麻、葡萄和山荊子等11種INH的理論等電點均為酸性等電點，其余9種作物INH蛋白質的理論等電點為堿性等電點。高含量氨基酸及其比例分析結果顯示，供試20種INH蛋白質高含量氨基酸主要為亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸和纈氨酸。穩定性預測分析發現，甘薯在內的12種INH蛋白質為穩定性蛋白質，南方菟絲子等其余8種INH蛋白質為非穩定性蛋白質。

表1 INH蛋白質理化性質的預測分析

2.2 INH蛋白質磷酸化位點預測及分析

以Threshold大于0.5為標準，如表2所示，預測參試的20種INH蛋白質磷酸化位點和數量結果表明,供試的INH蛋白質磷酸化位點數量最多的是絲氨酸，其次為蘇氨酸，此外番茄、馬鈴薯、小果咖啡、向日葵、黃花蒿、芝麻、糙葉山黃麻、蒺藜苜蓿、葡萄和蓖麻分別有1、1、1、3、2、1、2、1、1和1個磷酸化位點為酪氨酸。

表2 INH蛋白質磷酸化作用位點預測結果

續表2 Continued table 2

INH來源JAZ1蛋白磷酸化位點數量絲氨酸蘇氨酸酪氨酸粉紅鐘花860糙葉山黃麻1472蒺藜苜蓿8111葡萄21101蓖麻951橙子840山荊子1530

2.3 INH蛋白質的疏水性/親水性的預測和分析

如圖1所示，甘薯INH蛋白質IbINH多肽鏈第26，27位絲氨酸(S)分值最低，為-2.656，親水性最強；第54位甘氨酸(G) 分值最高，為2.278，疏水性最強；總體來看，INH蛋白質親水氨基酸數目大于疏水氨基酸數目，且親水性總平均值為-0.017，因此，推測IbINH蛋白質為親水性蛋白質。采用同樣的方法預測其他植物INH蛋白質疏水性/親水性，從預測結果推測辣椒、番茄、馬鈴薯、向日葵、黃花蒿、粉紅鐘花、糙葉山黃麻、蒺藜苜蓿、葡萄和山荊子等INH蛋白質為親水性蛋白質；而其余作物的INH蛋白質推測為疏水性蛋白質。

圖1 IbINH蛋白質親水性/疏水性預測Fig.1 IbINH protein hydrophobicity / hydrophobicity prediction

圖2 IbINH蛋白質信號肽預測Fig.2 IbINH protein signal peptide prediction

2.4 INH信號肽的預測分析

如圖2所示，IbINH蛋白質可能含有信號肽，信號肽概率為0.900，信號錨定概率為0.000，最大切割位點概率為0.856，位于17～18。

2.5 INH蛋白質跨膜結構域預測和分析

如圖3所示，未發現IbINH有明顯的跨膜結構域；其他INH蛋白質跨膜結構域預測結果顯示，向日葵、黃花蒿、蒺藜苜蓿和蓖麻等4種INH具有跨膜結構域，其中向日葵INH跨膜結構域位于13～35位氨基酸(圖4)；黃花蒿INH跨膜結構域位于20～42位氨基酸；蒺藜苜蓿INH跨膜結構域位于7～26位氨基酸；蓖麻INH跨膜結構域位于12～31位氨基酸。甘薯等其他16種物種中INH均未發現明顯的跨膜結構域。

2.6 INH蛋白質二級結構及各元件含量預測

對甘薯等20種作物INH蛋白質的氨基酸序列進行二級結構預測，如表3所示，供試INH蛋白質二級結構主要元件為α-螺旋，其所占比例為55.96 %～72.62 %；其次為無規則卷曲，其所占比例為21.89 %～29.05 %；延伸鏈所占比例較小，為3.57 %～12.44 %；β-轉角占比最低，為1.12 %～3.65 %。

圖3 IbINH蛋白質跨膜區預測Fig.3 IbINH protein transmembrane region prediction

圖4 向日葵INH蛋白質跨膜區預測Fig.4 Transmembrane region prediction for INH protein of sunflower

表3 INH蛋白質二級結構及各元件含量預測

2.7 INH蛋白質亞細胞定位預測和分析

如表4所示，供試INH可能定位在細胞質、細胞核、線粒體、內質網、胞外、高爾基體、液泡、過氧化物酶體、囊泡以及質膜等細胞器中，其中IbINH定位在細胞質的可能性最大，為26.1 %；定位在線粒體中的可能性其次，為17.4 %，也可能定位在細胞核、內質網、胞外、高爾基體和液泡等細胞器中。

2.8 INH蛋白質功能結構域的預測和分析

對INH蛋白質的功能結構域預測發現，供試植物INH蛋白質均含有典型的PMEI-like超級家族功能結構域(圖5)，因此，推測這些INH蛋白質可能具有較為相似的功能。

表4 INH蛋白質亞細胞定位預測

續表4 Continued table 4

INH來源蛋白質亞細胞定位細胞質細胞核線粒體內質網胞外高爾基體液泡過氧化物酶體囊泡質膜芝麻17.413.026.117.413.0-8.74.3--茶樹4.356.521.717.4------黃猴花34.817.434.84.3--8.7---粉紅鐘花21.717.417.413.013.04.313.0---糙葉山黃麻-11.122.2-66.7-----蒺藜苜蓿-11.122.2-66.7-----葡萄-52.234.8-13.0-----蓖麻--22.2-77.8-----橙子--22.233.333.3-11.1---山荊子4.382.68.7----4.3--

圖5 IbINH氨基酸序列功能域預測Fig.5 IbINH functional prediction of amino acid sequence

2.9 IbINH蛋白質同源建模分析

通過SWISS-MODEL在線軟件對IbINH進行蛋白質同源建模，模型如圖6所示，從該三維結構圖可以看出，IbINH的三維空間結構主要以α-螺旋為主，與二級結構預測結果基本一致。

3 討 論

近年來，隨著植物大規模的測序使得植物基因序列信息迅速地積累，且已證實蔗糖轉化酶抑制子在馬鈴薯[12]、玉米[13]、番茄[14-15]、煙草[16]等作物中廣泛存在。但對于該基因的克隆和功能闡述才剛剛開始。主要研究報道是在馬鈴薯中INH的功能研究發現該基因參與馬鈴薯塊莖低溫糖化的調控[17]；Biofig等[18-19]報道了在病原菌脅迫條件下，通過抑制轉化酶抑制子活性，可增強感染部分的己糖含量來抵御病菌的侵染；葉雪凌等[20]研究發現在黃萎病菌侵染后，野生茄根中StINH1呈下調表達，表明轉化酶抑制子可能參與植物防衛反應。

圖6 甘薯等INH蛋白質空間三位結構預測Fig.6 SWISS MODEL prediction of INH proteins

本研究利用前期研究中分離到的甘薯轉化酶抑制子全長ORF以及根據GenBank中已公布的INH同源序列，采用系列生物信息學軟件對其進行生物信息學分析，從中盡量發掘信息，從而有助于指導進一步的實驗研究。生物信息學分析結果表明，IbINH與其他作物中INH同源性并不高，但從二級結構預測結果來看，供試INH蛋白質二級結構主要元件均為α-螺旋，延伸鏈和β-轉角所占比例較少，且功能結構域預測發現供試植物INH蛋白質均含有典型的PMEI-like超級家族功能結構域，因此推測這些INH蛋白質可能具有較為相似的功能。但是，由于INH的序列同源性較低，僅僅通過序列分析很難準確預測不同作物中INH的功能，在甘薯中轉化酶抑制子是否具有參與調控甘薯抗病抗逆的功能值得我們下一步去深入研究。

4 結 論

本研究采用系列生物信息學軟件比較分析了包括甘薯在內的20種INH的氨基酸序列，結果顯示IbINH同其他作物中INH一樣均含有典型的PMEI-like超級家族功能結構域，二級結構組成和比例也比較相似，INH蛋白質定位在細胞質的可能性最大，但是各種INH的親疏水性、穩定性以及跨膜結構域等不盡相同。本文為進一步研究IbINH基因功能提供了參考，為改良甘薯抗性提供了重要的基因資源。