滇黃精營養(yǎng)器官的組織結(jié)構(gòu)及組織化學(xué)定位研究

朱新焰，楊竹雅，杜春華，王家金，錢均祥，曾 彪，王 麗，張智慧，石亞娜，叢 琨，冷 燕，楊 雁，杜 慧，季鵬章,*

(1．云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650223; 2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500; 3. 云南技師學(xué)院，云南 昆明 650300；4. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650205; 5. 滇西科技師范學(xué)院生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南 臨滄 677000)

【研究意義】滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hemsl)系百合科黃精屬多年生草本植物，藥用其根莖，是常用的藥食兩用的滋補中藥，已有2000多年的藥用歷史。滇黃精是2015版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定作為黃精使用的3種原生藥之一[1]。其主要活性成分，黃精多糖具有免疫激發(fā)和免疫促進、抗輻射、抗腫瘤、抗疲勞、耐缺氧及抗應(yīng)激等諸多作用[2]。滇黃精是一種價值很高的藥食兩用植物資源，隨著近年來以滇黃精為原料的藥品、保健品及日化用品的深入開發(fā)，其市場需求量日益增大，導(dǎo)致其野生資源稀缺，并且藥材或飲片的參偽現(xiàn)象十分嚴重。因此，滇黃精的各營養(yǎng)器官資源值得深入研究，探索并開發(fā)其非藥用部位及相關(guān)化學(xué)成分，從而可以減少資源的浪費和有效成分的流失[3-4]，對野生資源的保護及提高資源利用度有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)黃精的皂苷類成分也具有一定的藥理作用；但滇黃精中皂苷類成分則缺乏系統(tǒng)研究[5]?！厩叭搜芯窟M展】組織化學(xué)定位技術(shù)已較多的利用在多糖、皂苷、黃酮、生物堿等化學(xué)成分的研究上[6-8]。對滇黃精的研究主要集中在資源分布和根莖多糖成分的提取分離等方面[9-10]。目前，除玉竹、多花黃精等藥用植物的組織化學(xué)研究則有報道外[11-12]，尚未見對滇黃精各營養(yǎng)器官組織結(jié)構(gòu)及多糖、皂苷等成分的組織化學(xué)定位的研究報道?！颈狙芯壳腥朦c】目前，滇黃精以新鮮或干燥的根莖入藥，葉、莖、根等部位則是棄而不用，造成了這些資源的嚴重浪費。鑒于此，采用植物組織顯微技術(shù)和組織化學(xué)定位方法，研究滇黃精各營養(yǎng)器官的組織結(jié)構(gòu)及多糖、皂苷的組織分布和積累特征，拓展資源利用范圍[13]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對滇黃精各營養(yǎng)器官的組織結(jié)構(gòu)及多糖、皂苷定性和分布量進行研究分析，揭示滇黃精各營養(yǎng)器官的組織結(jié)構(gòu)特征和主要化學(xué)成分的蘊藏量，為滇黃精資源的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

滇黃精各營養(yǎng)器官樣品均采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物資源圃，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)楊樹德教授鑒定為滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hemsl)，樣品標本均保存在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物標本室。

藥品： 高氯酸、冰醋酸、香草醛、乙醇、高碘酸、亞硫酸氫鈉、品紅、偏重亞硫酸鈉等試劑均為分析純，水為純化水。

儀器：Nikon 80i型顯微鏡(日本尼康公司)；HS-2026型生物組織切片機；AR124CN電子分析天平(奧豪斯上海有限公司)；TGL-16M離心機(湖南湘儀儀器有限公司)；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)等 。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織顯微結(jié)構(gòu) 分別選取相同生長年限的滇黃精各器官樣品，用FAA液進行固定，乙醇梯度脫水，分別進行解剖及徒手切片和石蠟制片，切片厚度約10～35 μm，制片后于顯微鏡下詳細觀察各器官組織形態(tài)、構(gòu)造并拍照記錄。

1.2.2 多糖組織化學(xué)定位 分別對滇黃精的根、根莖、莖及葉進行制片，各器官樣品選取10張組織細胞結(jié)構(gòu)完整、清晰的切片進行染色。采用高碘酸-希夫試劑進行染色反應(yīng)，在不同倍數(shù)顯微鏡下觀察多糖儲存場所與分布特征。

1.2.3 皂苷組織化學(xué)定位 分別對滇黃精的根、根莖、莖及葉進行制片，各器官樣品選取10張組織細胞結(jié)構(gòu)完整、清晰的切片進行染色。采用等量的5 % 香草醛-冰醋酸和高氯酸試劑反應(yīng)并顯色后，在不同倍數(shù)顯微鏡下觀察多糖儲存場所與分布特征。

1.2.4 觀察方法及數(shù)據(jù)分析 對滇黃精樣品的不同器官，采用各器官分別取10張不連續(xù)的切片，每張切片的不同組織區(qū)域觀察6個不同視野的方法[8]；相同顯微倍數(shù)的視野觀察面積均相等，如40倍時為12×104μm2，(因葉片組織切片較窄，故選視野面積為4×104μm2)；統(tǒng)計不同組織各觀察視野中的顆粒狀(或液滴狀)多糖及皂苷數(shù)量，取平均值[14-15]。根據(jù)著色的細胞的多少、細胞中著色顆粒物或塊狀的大小、分布密度等依次劃為6個等級，從低到高依次用“-”表示極少或未見；“+”表示很少；“+ +”表示較少；“+ + +”表示略多；“+ + + +”表示很多；“+ + + + +”表示極多。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇黃精根的組織結(jié)構(gòu)及多糖、皂苷的分布與積累特征

2.1.1 根的顯微結(jié)構(gòu)特征 根被細胞1列，排列緊密，多呈不規(guī)則四邊形或橢圓形，有的呈類方形或類長方形，外側(cè)細胞壁明顯增厚。表皮細胞多為1列，多呈類六邊形或不規(guī)則多邊形；細胞較大，壁略厚，細胞內(nèi)可見顆粒狀或小塊狀物質(zhì)。皮層較寬，黏液細胞及針晶束少數(shù)，散在，細胞較小，直徑 155～280 μm。薄壁細胞中可見淀粉粒，直徑3～13 μm。維管束多為外韌型，其鞘細胞類長方形，壁略增厚。導(dǎo)管排列較緊密，呈輻射狀，直徑22～87 μm。根橫切面組織結(jié)構(gòu)見圖1。

2.1.2 根的多糖分布積累特征 多糖在根被、表皮和中柱中密度最高，這3個組織著色最深。而寬廣的皮層薄壁細胞和黏液細胞中均有分布，細胞中以顆粒狀多糖類物質(zhì)為主。中柱鞘細胞、韌皮部及木質(zhì)部細胞及導(dǎo)管多呈紫紅色。各組織多糖分布量為皮層≥中柱>根被及表皮。多糖數(shù)量及多度見表1，多糖分布特征見圖2。

2.1.3 根的皂苷分布積累特征 與根的多糖分布區(qū)域和積累量均有所不同，皂苷多數(shù)分布在表皮細胞內(nèi)；靠近表皮細胞的1～3列皮層薄壁細胞和少數(shù)韌皮部細胞內(nèi)有少量分布，而根被、皮層及中柱鞘細胞和維管束等部位則沒有或極少分布。各組織皂苷分布量為表皮>皮層≈維管束(韌皮部)。皂苷數(shù)量及多度見表1，皂苷分布特征見圖3。

表1 滇黃精根中各組織多糖、皂苷的分布量

a: 橫切面(10×); b: 根被及皮層(40×); c: 維管束(40×); Mu：黏液細胞；Ve：根被；Ep：表皮；Pa：基本薄壁組織；Co：皮層；Sc：厚壁組織；Pc：維管束鞘細胞；Vb：維管束；Ph：韌皮部；Xy：木質(zhì)部；Me葉肉細胞；Ra：針晶束；Sa：皂苷；Po：多糖，下同a: The cross-section (10× ); b: The velamen and cortex (40× ); c: The vascular bundles (40× ); Mu：Mucilage cell；Ve：Velamen；Ep：Epidermis；Pa：Parenchyma；Co：Cortex；Sc：Sclerenchyma；Pc：Vascular bundle sheath cell；Vb：Vascular bundle；Ph：Phloem；Xy：Xylem；Me: Mesophyll cell；Ra：Raphides；Sa：Saponin；Po：Polysaccharide, the same as below圖1 根組織結(jié)構(gòu)Fig.1 The tissue structure of root

圖2 根多糖分布Fig.2 Distribution of polysaccharides in root

圖3 根皂苷分布Fig.3 Distribution of saponins in root

表2 滇黃精根莖中各組織多糖、皂苷的分布量

2.2 滇黃精根莖的組織結(jié)構(gòu)及多糖、皂苷的分布與積累特征

2.2.1 根莖的顯微結(jié)構(gòu)特征 表皮細胞 1 列，多呈類長圓形或不規(guī)則多邊形，細胞壁略增厚，波狀排列，外被角質(zhì)層。皮層寬，有黏液細胞散在；內(nèi)皮層細胞 1 列，可見細胞凱氏點。黏液細胞與草酸鈣針晶束多數(shù)甚大，散布于皮層中，直徑約 210～435 μm，針晶長 60～205 μm?；颈”诮M織細胞大小不一，不規(guī)則形，可見較大單粒及復(fù)粒淀粉粒，直徑7～20 μm，復(fù)粒多由2～3分粒組成。維管束散列，周木型，近內(nèi)皮層處維管束外韌型。導(dǎo)管較小，直徑10～65 μm。根莖橫切面組織結(jié)構(gòu)見圖4。

2.2.2 根莖多糖分布與積累特征 根莖多糖主要分布在表皮和大多數(shù)皮層基本薄壁細胞、黏液細胞和維管束中。角質(zhì)層、表皮、韌皮部及木質(zhì)部細胞均顯紫紅色，皮層薄壁細胞壁均顯紅色，而細胞質(zhì)中以顆粒狀多糖物質(zhì)為主；有的可見單?；驈?fù)粒淀粉粒。該器官不同組織多糖分布量為皮層>維管束>表皮。多糖數(shù)量及多度見表2，多糖分布特征見圖5。

2.2.3 根莖皂苷分布與積累特征 根莖皂苷主要分布在表皮細胞、皮層薄壁細胞及木質(zhì)部細胞中；內(nèi)皮層以內(nèi)的薄壁組織細胞中則分布較少，而黏液細胞中則沒有分布。表皮及表皮以內(nèi)3～5層細胞質(zhì)中可見較多的小團塊狀、顆粒狀皂苷類物質(zhì)，這些組織的細胞壁通常也著色較深；而韌皮部細胞則不顯色。組織皂苷分布量為皮層>維管束>表皮。皂苷數(shù)量及多度見表2，皂苷分布特征見圖6。

a：橫切面(4×)； b：表皮及皮層(40×)； c： 維管束(40×), 下同a: The cross-section (4× ); b: The epidermis and cortex (40× ); c: The vascular bundles (40× ), the same as below圖4 根莖組織結(jié)構(gòu)Fig.4 Tissue structure of rootstock

圖5 根莖多糖分布Fig.5 Distribution of polysaccharides in rootstock

圖6 根莖皂苷分布Fig.6 Distribution of saponins in rootstock

圖7 莖組織結(jié)構(gòu)Fig.7 Tissue structure of stem

2.3 滇黃精莖的組織結(jié)構(gòu)及多糖、皂苷的分布與積累特征

2.3.1 莖的顯微結(jié)構(gòu)特征 表皮細胞 1 列，呈類圓形或類方形，細胞排列緊密，稍彎曲。厚壁組織以外皮層較窄，常由4～6層細胞組成，大小較均勻；可見較多的小塊狀物質(zhì)及淀粉粒，直徑4～15 μm。厚壁組織由3～4層細胞組成，較窄處僅有1層細胞，主要由木纖維組成。厚壁組織內(nèi)側(cè)皮層較寬，細胞排列較疏松，大小不一，塊狀、顆粒狀物質(zhì)少見。皮層偶見黏液細胞及針晶束。維管束散列，外韌型，近厚壁組織處多為周韌型，導(dǎo)管偏小，直徑18～46 μm。莖橫切面組織結(jié)構(gòu)見圖7。

2.3.2 莖多糖分布與積累特征 莖多糖主要分布在厚壁組織外側(cè)的皮層、纖維束環(huán)(厚壁組織)和維管束中。表皮細胞中有少量多糖分布，而纖維束環(huán)以內(nèi)的皮層組織中則分布極少。厚壁組織及維管束細胞均著紫色或紅色，皮層薄壁組織則可見顆粒狀或塊狀多糖累物質(zhì)。莖中各組織多糖分布量為維管束≥厚壁組織>厚壁組織外側(cè)皮層>表皮≈厚壁組織內(nèi)側(cè)薄壁組織。多糖數(shù)量及多度見表3，多糖分布特征見圖8。

2.3.3 莖皂苷分布與積累特征 莖皂苷主要分布在厚壁組織及表皮細胞中，皮層(厚壁組織外側(cè))和韌皮部細胞中有少量分布，內(nèi)側(cè)皮層則分布極少。厚壁組織顯黃色，表皮和韌皮部細胞顯淺紅色，而皮層有部分細胞則顯綠色，顯示莖中不僅有三帖皂苷，還可能有甾體皂苷。各組織皂苷分布量為厚壁組織>厚壁組織外側(cè)皮層>表皮>維管束>厚壁組織內(nèi)側(cè)薄壁組織≈0。皂苷數(shù)量及多度見表3，皂苷分布特征見圖9。

表3 滇黃精莖中各組織多糖、皂苷的分布量

圖8 莖多糖分布Fig.8 Distribution of polysaccharides in stem

圖9 莖皂苷分布Fig.9 Distribution of saponins in stem

2.4 滇黃精葉的組織結(jié)構(gòu)及多糖、皂苷的分布與積累特征

2.4.1 葉的顯微結(jié)構(gòu)特征 葉為等面葉，由表皮、葉肉及葉脈組成。上下表皮細胞各 1 列，多呈長方形或類方形，有的類圓形或不規(guī)則形，排列緊密。葉肉薄壁細胞5～6層，類橢圓形，排列不甚緊密，細胞內(nèi)可見大量葉綠體。維管束由初生木質(zhì)部、韌皮部組成，韌皮部位于下表皮一側(cè)，木質(zhì)部由導(dǎo)管、管胞和木纖維組成，導(dǎo)管直徑約22～30 μm。葉片橫切面組織結(jié)構(gòu)見圖10。

2.4.2 葉片多糖分布與積累特征 多糖集中分布在葉肉薄壁組織細胞和葉脈中；表皮細胞中有少量多糖，其細胞壁顯淡紅色。多數(shù)葉肉薄壁組織細胞、維管束韌皮部及木質(zhì)部細胞均顯紫色或紅色，這些部位有大量多糖存在；葉肉細胞中以淀粉粒類多糖最為常見。葉中不同組織多糖分布量順序為葉肉細胞>葉脈>表皮；多糖數(shù)量及多度見表4，多糖分布特征見圖11。

2.4.3 葉片皂苷分布與積累特征 與多糖分布有所不同，皂苷主要集中在葉肉薄壁細胞中，其次為上、下表皮細胞，而維管束中則基本沒有分布。葉肉及表皮細胞均顯淡紫色或粉紅色，維管束韌皮部則顯淡黃色，只有極少皂苷分布。各組織皂苷分布量為葉肉細胞>表皮>葉脈。多糖數(shù)量及多度見表4，皂苷分布特征見圖12。

2.5 滇黃精各營養(yǎng)器官多糖、皂苷分布量比較

在相同觀察視野面積下，對各營養(yǎng)器官內(nèi)多糖、皂苷的分布進行統(tǒng)計分析，多糖與皂苷在各營養(yǎng)器官中的平均分布量由多到少均為根莖>葉片>莖>根。平均分布量及分布密度比較見表5、圖13。

3 討 論

通過對滇黃精4種營養(yǎng)器官的解剖與切片觀察，闡明并測量出了黏液細胞、針晶體、導(dǎo)管、淀粉粒等組織細胞的形態(tài)、大小等特征。經(jīng)過組織化學(xué)定位，明確了滇黃精2種主要次生代謝產(chǎn)物的分布場所、數(shù)量和密度；根和葉的次生代謝產(chǎn)物分布較為均勻，絕大多數(shù)分布在皮層薄壁細胞、葉肉細胞及維管束中。而根莖和莖中次生代謝產(chǎn)物則出現(xiàn)組織分布不均勻的情況。莖中兩類物質(zhì)以厚壁組織外側(cè)薄壁組織、厚壁組織、維管束3個區(qū)域內(nèi)居多，而厚壁組織內(nèi)側(cè)皮層則分布很少；可能與輸導(dǎo)組織徑向輸送物質(zhì)而形成的屏障有關(guān)。根莖則以外皮層和維管束中的分布密度較高，這與植物基本薄壁組織儲藏代謝產(chǎn)物的功能相統(tǒng)一。黏液細胞中均有多糖分布，而未見皂苷類物質(zhì)。由此可見，在一些藥材良種選育時，以某些器官中基本薄壁組織的厚薄及黏液細胞的數(shù)量作為一個重要指標，具有一定的指導(dǎo)意義。

表4 滇黃精葉中各組織多糖、皂苷的分布量

a：橫切面(10×)； b：主脈維管束(40×)；c：表皮、葉肉細胞及側(cè)脈維管束(40×)，下同a:The cross-section (10×); b: The major vein (40×);c: The epidermis, mesophyll cells and lateral vein (40×), the same as below圖10 葉片組織結(jié)構(gòu)Fig.10 Tissue structure of leaf

圖11 葉片多糖分布Fig.11 Distribution of polysaccharides in leaf

圖12 葉片皂苷分布Fig.12 Distribution of saponins in leaf

表5 滇黃精各器官多糖、皂苷分布量分析

圖13 滇黃精各營養(yǎng)器官多糖及皂苷分布量Fig.13 Distribution of polysaccharides and saponins in different organs of Polygonatum kingianum

值得注意的有2點，一是皂苷類物質(zhì)在滇黃精中也有較高的分布量，近年來也有對黃精類藥材中非多糖成分的研究報道，但某些成分的藥理活性尚不明確，后續(xù)研究工作中有待進一步對該類藥材的皂苷及其它類成分進一步研究。二是若將顯微視野觀察面積定為12×104μm2，葉片多糖與皂苷平均分布量分別占根莖的62 %和57 %左右；這可能與葉片表面積較大，在進行光合作用時合成了較多的糖類物質(zhì)有關(guān)。莖中多糖和皂苷亦分別占根莖的29 % 和44 %。另外，葉和莖等非藥用部位占滇黃精的總生物量約25 %～30 %，而在該類藥材的利用中，葉片等部位是棄而不用的。近年來，隨著滇黃精類藥材需求量的不斷提高，藥材價格也在不斷攀升，野生資源不斷衰竭，而栽培品系又不能及時供給市場，導(dǎo)致了飲片、生藥的混偽品充斥市場，該項研究可為滇黃精葉片等部位的綜合開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果揭示了滇黃精各器官的組織構(gòu)造特征，可以作為滇黃精基源植物、藥材、飲片等的鑒別依據(jù)；明確了滇黃精的各營養(yǎng)器官的各組織多糖和皂苷的儲存場所和分布特征。目前，對黃精類藥材的化學(xué)成分的研究主要體現(xiàn)在多糖類物質(zhì)方面，皂苷類化學(xué)成分的研究鮮見報道；而實驗結(jié)果顯示，滇黃精各營養(yǎng)器官中均含有一定量的皂苷類物質(zhì)。因此，應(yīng)重視對皂苷類化學(xué)成分的深入研究；同時，也需要加大對滇黃精地上營養(yǎng)器官的發(fā)掘，從而提高藥效成分及該類藥用植物資源的綜合利用度。