桑輪紋病病斑內部及周邊真菌群落結構研究

王 謝，李星月，尹詩琳,3，唐 甜，張建華*

(1. 四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066; 2. 四川省農業科學院植物保護研究所，四川 成都 610066; 3. 四川農業大學林學院，四川 成都 611130)

【研究意義】桑輪紋病又稱桑輪斑病，是一種桑樹真菌病害，長期影響著亞洲諸國的蠶桑生產。【前人研究進展】1980年，該病被Takahashi等[1]在日本首次報道，稱為zonate leaf spot of mulberry ，并指出該病的病原菌為“Gonatophragmiummori”。后Takahashi等[2]又調查指出其寄主涉及16科24屬 28植物種，完整描述了該病原菌的整個生活史階段。1999年，該病被Maji等[3]在印度發現 ，稱為brown ring leaf spot disease of mulberry，并指出其病原菌為Cephalosporiumstrictum。我國從20世紀80年代開始對該病進行報道研究，1994年首次正式報道了廣西百色蠶區發生的桑輪紋病災情[4]，2007年江西修水縣爆發了桑輪紋病并呈較快的蔓延趨勢[5]，2011年浙江淳安縣也報道了一起特大桑輪斑病災害事件[6]，2012年云南省昭通地區也首次報道了該地區出現的桑輪紋病[7]。2016年，筆者在四川眉山地區調研時發現桑輪紋病是當地每年必發生的一種病害，在隨后的兩年里，又在四川綿陽地區、四川仁壽地區、重慶潼南地區等地發現大面積桑樹輪紋病病害。【本研究切入點】雖然桑輪紋病的傳統植物病理學研究已經有了一定的基礎，但其具體的宿主-環境微生物-病原菌之間的關系研究尚處于空白。【擬解決的關鍵問題】因此，本研究試圖利用高通量測序分析技術探索桑輪紋病病斑內部及周邊的真菌群落結構，為未來進一步揭示桑輪紋病的致病機理和構建其綠色防治技術體系提供理論基礎和數據基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品的前處理和采集

2017年10月31日，在青神桑輪紋病發病桑園中隨機選取10株發病桑樹，每株樹上取10片成熟的具有桑輪紋病病斑的桑葉，用95 %的乙醇將葉片表面消毒2次，再用無菌水沖洗2次，并用無菌濾紙拭干。然后，根據病斑在葉片上的空間位置劃分出病斑的核心區(簡稱H區)、病斑的邊緣區(簡稱L區)和病斑周圍的未發病區(簡稱N區)3個特定區域(圖1)。其中，H區是指從外向內第2圈層及其以內的所有輪狀圈層所涉及的區域，顏色通常表現為枯黃色；L區是指最外層輪狀圈層(該層外半徑r1-內半徑r0=距離a，顏色通常為棕色)及其相連的外半徑為(r1+ 1.5×a)的輪狀圈層(顏色通常為綠色)。N區是指與L區外緣相鄰的外半徑為(r1+

H: 病斑的核心區; L: 病斑的邊緣區; N: 病斑周圍的未發病區; a: 距離H: Core area of lesion; L: Marginal area of lesion; N: Peripheral area of lesion; a: Distance圖1 桑輪紋病病斑特定取樣位置的設定Fig.1 Setting schematic of specific sampling location for mulberry ring sheath lesions

4.5×a)的輪狀圈層，顏色通常為綠色。接著，每片葉子取1個病斑，并在超凈工作臺下用手術剪刀分別剪下H區、L區和N區。最后，按照病斑的位置將剪下的H區、L區和N區分別混合為3個不同的待測樣品，用病斑位置的簡稱分別將樣品命名為H、L、N，并將其放入4 ℃冰箱中待測。

1.2 高通量宏基因組微生物測序的樣品處理

參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的使用說明書進行DNA提取，提取DNA后進行DNA完整性檢測。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應應加入的DNA量。PCR所用的引物為已經融合了Miseq測序平臺的ITS1-2通用引物。ITS1F引物為CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode) CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，ITS2R引物為GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC。PCR結束后，PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測。真菌PCR產物和其他擴增片段小于400bp的PCR產物，選用0.8倍的磁珠處理。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1的等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。該環節委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 數據分析

基于對reads數據的拼接、過濾、去嵌合及非特異性擴增序列的數據前處理，分別進行OTU聚類分析、Alpha多樣性分析、物種分類分析、多維度分析和物種分類樹分析。

2 結果與分析

2.1 測序序列長度分析

質量控制后，平均剩余序列52 205條，平均序列長度229.22 bp(表1)。

2.2 桑輪紋病病斑及周邊內真菌的OTUs數

各樣品文庫的覆蓋率為0.99，表明樣本中序列沒有被測出的概率越低，本次測序結果可代表樣本的真實情況。在97 %的相似水平下，進行生物信息統計分析，共計比對1822個OTUs。其中，H區有604個OTUs，L區有499個OTUs，N區有974個OTUs。由圖2可知，H、L和N區3個區域內的真菌存在明顯差異，其共有OTUs較少，而多為獨有的OTUs。

2.3 桑輪紋病病斑內部及周邊的真菌群落結構

經過鑒定發現，除未鑒定的物種(圖3中的unclassified)外，在種水平上H區中相對豐度排名前5的真菌分別是Gonatophragmiumtriuniae、Myrotheciumroridum、Bannoahahajimensis、Incertaesedissp.和Hannaellaoryzae，其相對豐度分別為96.25 %、1.04 %、0.39 %、0.37 %和0.27 %；L區中相對豐度排名前5的真菌分別是Gonatophragmiumtriuniae、Myrotheciumroridum、Bannoahahajimensis、Strelitzianaalbiziae和Cercosporaapii，其相對豐度分別為96.95 %、0.48 %、0.13 %、0.13 %和0.09 %；N區中相對豐度排名前5的真菌分別是Gonatophragmiumtriuniae、Strelitzianaalbiziae、Chaetothyriaceaesp.、Myrotheciumroridum和Ascomycotasp.，其相對豐度分別為31.29 %、13.24 %、6.99 %、6.84 %和6.39 %。

表1 測序數據處理后的結果統計表

圖2 桑輪紋病病斑特定取樣位置共有的和獨有的OTU數目Fig.2 Number of common and unique OTUs at specific sampling locations of mulberry ring sheath patches

2.4 桑輪紋病病斑內部及周邊的真菌多樣性

H、L和N區的Shannon多樣性指數值分別為0.36、0.30和3.56，表明桑葉上病斑區內生真菌多樣性低于周邊未發病區。

2.5 桑輪紋病病斑內部及周邊的真菌之間相關性

將除未鑒定的物種(圖3中的unclassified)外，H、L和N區排名前5的真菌的相對豐度進行泊松相關性分析，結果發現：病斑內G.triuniae與B.hahajimensis、Incertaesedissp.、H.oryzae、S.albiziae、Chaetothyriaceaesp.、C.apii和Ascomycotasp.呈顯著的負相關關系，其相關系數分別為-0.97、-0.99、-0.83、-1.00、-1.00、-1.00和-1.00。而其他真菌之間呈現顯著的正相關關系，相關系數皆大于0.82。這表明桑輪紋病病斑的內部及周邊真菌G.triuniae與其他真菌存在著激烈的競爭。

3 討 論

3.1 桑輪紋病的病原真菌有待進一步確定

圖3 桑輪紋病病斑特定取樣位置的種水平上內生真菌分布Fig.3 Endophytic fungi distribution at species level at specific sampling location of mulberry ring sheath disease

本研究中病斑H和L區相對豐度最大的真菌為G.triunia，而報道的桑輪紋病的病原真菌為G.mori[1]。鑒于發病樣品中檢測到的最大相對豐度真菌與傳統描述的病原真菌作為同屬真菌，且測得的病原真菌序列與文庫中G.triunia的序列比對相似度為100 %，在此，可初步認為G.triunia為桑輪紋病的病原真菌。但必須注意的是，由于目前比對文庫中沒有G.mori的序列記載，加之高通量測序原理上存在不完整性，G.triunia與G.mori是否為同一個種，及兩者序列之間的差異到底有多大，這是尚未可知的。在尚未明確兩者是同一菌種的前提下，未來還需要進一步分離桑輪紋病病原真菌并進行遺傳鑒定。

3.2 桑輪紋病病斑的不斷擴大與病原真菌的相對豐度密切相關

桑輪紋病病斑的不斷擴大與病原真菌的相對豐度密切相關。在桑輪紋病病斑周圍N區中依然存在著31.29 %相對豐度的病原真菌(G.triunia)，這表明病斑的不斷增大與葉片內病原真菌相對豐度的增加密切相關，且30 %的病原真菌相對豐度絕對不是其出現病斑的環境閾值。對比出現病斑的地方(L和H區)，病原真菌的相對豐度都已經達到了96 %以上。

3.3 桑輪紋病病斑內病原真菌種群優勢的建立主要依賴于植物毒素

病原真菌(G.triunia)在桑葉內表現出明顯的競爭優勢。Kinjo 等[8]于1987年研究發現桑輪紋病病原真菌可以釋放植物毒素，并對這些毒素的結構進行了研究。這表明桑輪紋病病斑內病原真菌種群優勢的建立主要依賴于其釋放的植物毒素在真菌種群拮抗競爭過程中所起到的作用，所以它與其它主要真菌之間都呈現顯著的負相關關系。

3.4 桑輪紋病病斑中心穿孔可能與Myrothecium roridum有關

桑樹輪紋病發展到后期，中心會出現穿孔的現象。反觀在桑輪紋病病斑H區，真菌M.roridum的相對豐度比L區高；因此，研究猜測在真菌M.roridum會在病原真菌(G.triunia)利用完葉內生長資源后對葉片進行二次資源利用。經觀察，H 區組病斑類似枯葉，微生物可利用的主要部分為葉表皮的角質層。這表明了真菌M.roridum在進行二次資源再利用時，需要對角質蛋白具有明顯的可利用性。經查，真菌M.roridum為桑樹漆斑病的病原菌[9-11]，其習性就是喜角質蛋白[12]。真菌M.roridum的這一習性基本可以回答如此假設，即H區中心出現的穿孔是由M.roridum分解完葉表皮的角質層后所留下的。雖然這需要更多的試驗進行進一步的論證，但這也暗示了桑輪紋病病斑形成機理的復雜性，從病原菌的附著到病斑的出現、再到擴大和穿孔，整個過程涉及多種真菌的作用，這將為揭示桑輪紋病致病機理和研究綠色防控技術提供重要的參考依據。

4 結 論

在種水平上桑輪紋病發病葉片的病斑核心區(H區)、病斑邊緣區(L區)和病斑周圍的未發病區(N區)的真菌G.triuniae相對豐度排名皆是最高，分別為96.25 %、96.95 %和31.29 %。真菌M.roridum在H區的相對豐度為1.04 %，是L區的相對豐度2.17倍。該結果揭示了桑輪紋病病斑形成過程是復雜的，病斑的出現、擴大和穿孔是多種真菌共同作用的結果。此外，研究結果還引出了桑輪紋病病原菌G.mori與數據庫100 %比對的真菌G.triuniae是否為同一種病原微生物需要進一步確定的科學問題。