廣西2株H9N2亞型豬源流感病毒的HA基因序列分析

孔子榮，李 凡，李三木，何奇松，曾詠芳，楊可妍，馮淑萍 ，孫翔翔，熊 毅，顏健華*

(1.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學醫學院，廣西 南寧 530004；3.廣西動物疫病預防控制中心，廣西 南寧 530001)

【研究意義】豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)可引起豬群暴發急性、高度接觸性傳染病，屬于正粘病毒科A型屬單股負鏈分節段RNA病毒，由8個獨立RNA片段組成，分別編碼流感病毒結構蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和M2)和非結構蛋白(NS1和NS2)[1]。20世紀70年代之前，豬流感主要在歐美大陸以地方性方式流行，之后傳到我國，迄今已遍布世界各地。SIV在以不為人知的速度和方式悄然進化，而豬作為“混合器”和“孵育器”[2]，扮演著流感病毒進化的中間宿主角色。在豬群中流行的流感病毒亞型包括H1N1、H3N2、H1N7、H4N6、H5N1和H9N2等，而H9N2亞型流感病毒相對于H5N1亞型流感病毒更容易跨越物種屏障，可在人群中傳播[3]。因此，對SIV進行序列分析不僅對其流行防控意義重大，還具有重要的公共衛生學意義。【前人研究進展】流感病毒8個基因節段中的HA基因編碼血凝素蛋白，該蛋白是流感病毒重要的表面蛋白，可與靶細胞表面的唾液酸受體位點結合，幫助病毒顆粒黏附于細胞表面而侵入細胞，種間傳播的機制取決于HA序列上受體結合位點與宿主細胞表面病毒受體的結合特性[4]。HA蛋白的裂解性、受體特異性和糖基化是決定流感病毒感染性和致病性的重要因素[5]，因此HA基因研究是流感病毒研究工作的重要熱點。較多學者對各亞型流感病毒也進行了流行病學調查及基因組測定等研究[6]，如魏東等[7]建立H9N2亞型豬流感病毒感染BALB/c小鼠動物模型，為研究病毒致病機制提供模型動物；殷斌等[8]對山東H9N2亞型豬流感病毒進行了分離鑒定及遺傳進化分析；劉曉敏等[9]建立了禽源H9N2亞型豬流感病毒反向遺傳操作技術平臺；孫王楊吉等[10]對江蘇分離的1株H9N2亞型豬流感病毒進行了遺傳進化和致病性分析。張玉霞等[11]對分離的1株產蛋高峰雞H9N2進行HA基因序列分析，發現目前H9N2病毒亞型呈現變異趨勢，毒力雖未增強，但能逃避某些疫苗所誘導抗體的保護作用。張瑞華等[12]利用表達的H9N2亞型豬流感病毒HA重組蛋白，建立了H9亞型豬流感病毒抗體的LAT檢測方法。【本研究切入點】近年來，低致病性H9N2亞型流感病毒的宿主范圍越來越寬，對HA基因的研究在疫情監測和跨種間傳播機制等方面均具有重要意義，但目前國內缺乏豬源H9N2流感病毒的HA基因分析數據。【擬解決的關鍵問題】對2011年從廣西百色某豬場分離獲得的2株H9N2豬流感病毒分離株的HA基因進行同源性比對、進化分析和編碼蛋白氨基酸重要功能位點闡述，了解廣西H9N2亞型SIV的分子生物學特征及病毒的遺傳變異特點，為廣西豬流感疫情監控和人流感的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

H9N2病毒株A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011(以下稱P2和P3)均由廣西動物疫病預防控制中心從廣西百色市樂業縣送檢的豬肺臟組織病料分離鑒定并保存。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

主要試劑及引物：RNA提取試劑盒及質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；AMV反轉錄酶及相關試劑、TaqDNA聚合酶和pMDl8-T載體等購自寶生物工程(大連)有限公司。用于擴增H9亞型豬流感病毒HA全基因的引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 HA全基因測序及分析

將已分離鑒定病毒株的種毒使用PBS液稀釋1000倍后，按每枚0.2 mL接種9日齡SPF雞胚，收取24～96 h雞胚的尿囊液，對經血凝試驗鑒定為流感病毒陽性雞胚尿囊液進行病毒總RNA提取。使用隨機引物Uni12反轉錄合成的cDNA為模板，進行PCR擴增全長HA基因片段。再經1 %瓊脂凝膠電泳后回收PCR產物進行pMDl8-T克隆，鑒定為陽性的克隆質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，最后利用DNAstar對測序結果進行序列拼接和分析，并以MEGA 5.0繪制遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 廣西分離株HA基因序列的測定結果

經序列測定，P2和P3分離株的HA基因全長1701 bp，開放閱讀框(ORF)全長1683 bp，共含有560個氨基酸。分離株和24株參考序列核苷酸和氨基酸的同源性比對結果見表2。其中，在與禽源H9N2亞型流感病毒比較中，P2和P3分離株與A/ChickeiVFiyian/G9/09的核苷酸同源性最高，為98.3 %，氨基酸同源性最高，為98.2 %，二者與北美分離株A/Turkey/Wisconsin/1/66的同源性最低；在與人源H9N2亞型流感病毒的同源性比較中，核苷酸同源性在87.5 %～92.7 %，氨基酸同源性在88.1 %～90.1 %；在與豬源H9N2亞型流感病毒的比較中，與A/Swine/Shanghai/Yl/2009的同源性最高，與A/Swine/Korea/Y452/2004的同源性最低，核苷酸同源性在83.7 %～94.8 %，氨基酸同源性在86.6 %～97.0 %。

表1 引物序列

2.2 HA基因的遺傳進化分析結果

從圖1可看出，P2和P3分離株的HA基因與A/Duck/HongKong/Y280/97病毒同屬歐亞譜系的Y280亞系；與BJ型代表毒株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/HongKong/G9/97和A/Chicken/Shanghai/F/98等親緣關系較遠，與代表毒株A/Duck/HongKong/Y439/97和A/Quail/HongKong/Gl/97的親緣關系最遠。

2.3 HA基因的受體結合位點和裂解位點分析

由表3可知，H9N2亞型豬源流感的HA蛋白裂解位點位于335～341 aa間，2株分離株的裂解位點附近氨基酸均為-RSSRGLF-；HA蛋白球狀受體結合位點由第109、161、163、191、198、202、203、146～150和232～237位氨基酸構成；與參考毒株比較，109、161、163、202和203位較保守；第198位與CK/HK/G9/97和CK/SH/F/98均為精氨酸(R)，表明198位點對受體結合的親和力具有影響，親和力排序為纈氨酸(V)>蘇氨酸(T)>精氨酸R[13]；第234位發生了谷氨酰胺(Q)→亮氨酸(L)變化，前者存在于禽流感病毒中，后者存在于人流感病毒中。因此，廣西的P2和P3分離株具有與人和豬流感受體結合的特性。

表3 HA連接肽序列及病毒結合受體結合的相關氨基酸

注：-代表潛在糖基化位點缺失，+代表潛在糖基化位點不缺失。

Note:- stands for potential glycolation site absent，+ stands for not missing.

2.4 HA基因糖基化位點分析

分離株HA蛋白具有8個保守的潛在糖基化位點，分別位于HA1鏈29、141、218、298、305、313位點和HA2鏈492、551位點(表4)。其中313位點上發生了脯氨酸(P)→絲氨酸(S)變化，導致新增一個潛在的糖基化位點，該位點在HA1和HA2裂解位點附近，位點的糖基化可影響HA鏈裂解，可能導致病毒的毒力和抗原性發生變化。

3 討 論

H9N2亞型流感病毒的HA基因演化主要在其北美和歐亞兩大分支中存在，其中北美分支以A/Turkey/Wisconsin/1/66為代表毒株，歐亞分支中存在3個亞分支，分別是以A/Duck/HongKong/Y280/97為代表的Y280-like、以A/Quail/HongKong/G1/97為代表的Gl-like和以A/Duck/HongKong/Y439/97為代表的Y439-like，我國大陸大部分分離株主要屬于Y280-like分支，在Y280-like亞分支中還有2個亞分支[14]。從HA基因的遺傳進化樹圖可看出，本研究的毒株SW/GX/P2/2011和SW/GX/P3/2011均屬于歐亞分支中的Y280-like，相較于其他物種來源的流感病毒HA基因，其與禽源HA基因的親緣關系更近，說明本研究的HA基因應來源于禽源H9N2亞型流感病毒，與伍和明等[15]分析認為H9N2亞型SIV的HA基因在遺傳演化分支中屬于Y280-like亞分支、且來源于禽的觀點基本一致，表明在幾年間廣西地區豬H9N2流感病毒HA基因均處于相對穩定狀態，未出現明顯的抗原漂移或突變，可能與H9N2亞型流感病毒具有適應性感染豬只的某些HA基因特征有關，具體的感染和致病機理需進一步探究。但值得注意的是，在基因的遺傳進化樹中出現了與試驗毒株HA基因核苷酸同源性極高的犬H9N2亞型流感病毒，說明該型流感病毒具備感染其他哺乳動物的基因特征，提示應警惕H9N2亞型流感的跨種屬傳播問題，與伍和明等[15]的研究結果一致。本研究中2株分離株的氨基酸裂解位點在335～341 aa間，為RSSR↓GLF，表明HA1和HA2是由兩個堿性氨基酸互相連接，沒有多個堿性氨基酸插入，具有低致病性禽流感病毒特點，但從核苷酸水平分析，絲氨酸(S)與精氨酸(R)僅有一個堿基的差異，即AGC/AGU-AGG/AGA，因此，此位點附近的氨基酸有突變成堿性氨基酸類(R)的可能，從而使病毒的毒力增強。

H9N2亞型流感病毒的HA蛋白受體結合位點形成一個球狀結構，由第109、161、163、191、198、202和203位的氨基酸組成。本研究的2株分離株在HA蛋白上的第109、161、163、202和203位均高度保守，在198位上為丙氨酸(A)，在其他位為纈氨酸(V)、蘇氨酸(T)和谷氨酸(E)，符合Y280-like亞分支毒株的分子標志。Weis等[16]對H3亞型流感病毒位點進行分析發現，當H9亞型流感病毒HA蛋白的234位為亮氨酸(L)時，具有結合SAα-2和6Gal受體特異性，優先與人的流感病毒受體蛋白結合，而HA蛋白的234位為甘氨酸(G)時具有結合SAα-2和3Gal受體特異性，優先結合禽的流感病毒受體，當HA蛋白的234位為蛋氨酸(M)時則對2種受體具有相同的結合能力。本研究中2株分離株的234位氨基酸均為亮氨酸(L)，說明2株分離株具有與人流感受體結合的傾向。

HA蛋白上的糖基化位點對維持HA分子結構及功能至關重要，例如裂解位點附近的寡糖鏈可形成空間屏障進而阻礙HA蛋白裂解[17]。本研究的2株流感病毒株均存在于8個糖基化位點，其中29、141、218、298、305、492和551位點與參考毒株均無明顯差異，第313位點由于發生了脯氨酸(P)→絲氨酸(S)變化，導致增加了一個糖基化位點，這是病毒毒力的進化還是病毒對宿主的適應尚需進一步探究。Baigent和Mccauley[15,18]應用H3模型研究Hl、H5和H7等亞型毒株的HA糖基化位點時發現，HA蛋白的158位有糖基化位點而NA頸部有氨基酸缺失，或158位沒有糖基化位點而NA頸部無氨基酸缺失，可保證病毒有效生長。本研究2株分離株HA蛋白的158位無糖基化位點而NA頸部無氨基酸缺失，說明該2株病毒可在宿主體內有效生長。

4 結 論

廣西2株H9N2亞型豬源流感病毒分離株A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011的HA基因屬于歐亞普系的Y280亞系，從HA基因的基因層次分析2株分離毒株均有毒力增強趨勢并能在宿主體內良好復制，具備典型的低致病性和與人流感受體結合的特征。因此，今后應加強對H9N2亞型豬源流感病毒的監測及防控，防止該型流感病毒和其他亞型流感病毒在豬體內發生基因重排，引發更嚴重的傳播后果。