不同激活方法對金華豬單精注射胚胎體外發育的影響

屠平光，項 云，章嘯君，胡旭進

(金華市農業科學研究院，浙江 金華 321007)

胞漿內單精子注射(ICSI)技術是一種體外受精技術，對于受精機理的研究、野生動物和瀕臨滅絕動物的保護、優秀公畜精子的利用，以及男性不育的治療等方面具有重要意義。2000年，Martin采用體內成熟卵母細胞經ICSI首次得到存活的小豬。與其他物種相比，豬ICSI技術還不完善。由于ICSI避開了傳統受精的精卵結合激活卵母細胞的過程，因此，與傳統的受精過程不同[1]，胞質內顯微受精不進行激活處理的卵母細胞，其體外發育率很低，不能發育到囊胚階段，說明注射管的機械刺激不足以激活卵子[2]。而卵母細胞激活失敗是ICSI受精失敗的主要原因[3]。因此，卵母細胞激活對提高卵母細胞胞質內單精子注射的成功率具有重要作用[4-5]。不同的激活方法、激活劑的選擇，對卵子激活后的卵裂率、囊胚發育率均有較大程度影響。本試驗研究了采用不同激活方法對金華豬ICSI胚胎體外發育的影響，為后期開展核移植提供足量、優質的胚胎和高效、穩定的激活方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 試驗所用試劑除特別說明外，均為sigma公司產品。卵母細胞成熟液為TCM-199基礎培養液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10%PFF+10%血清；融合/激活液由0.25 mol/L甘露醇，0.1 mmol/L氯化鈣，0.1 mmol/L氯化鎂，0.5 mmol/L HEPES以及0.01%PVA組成；胚胎培養液為NCSU-23+4 mg/mL BSA+10%血清。體視顯微鏡(Olympus TRPT-4045型)；CO2培養箱(Thermo311)；倒置顯微鏡(Olympus-CKX41)。

1.2金華豬卵母細胞的準備 卵母細胞體外成熟培養44 h后，放入含有0.1%透明質酸酶的洗卵液中，輕輕地用吸管吹打去掉顆粒細胞，挑選胞質飽滿均勻、排出pbI的卵母細胞，用TCM-199培養液和獲能液 (mTBM)洗3次，移入已平衡的mTBM微滴(50 μL)中，上覆石蠟油。每滴置卵母細胞18枚左右，放入CO2培養箱中備用。

1.3金華豬精子的準備 將新鮮采集的精液迅速帶回實驗室,用預熱到37℃的BTS洗精液稀釋,精子獲能取0.5 mL稀釋精液小心置于含有5 mL mTBM受精液的圓底試管底部,懸浮30 min后,將上層液吸出,離心洗滌及濃縮一次,取BTS重懸,使其濃度為1×106個/mL。按照精子預處理方法的不同,對重懸稀釋的精子進行處理。(1)新鮮精子顯微操作:直接移動BTS稀釋的精子2 μL放置到準備好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盤中備用。(2)液氮一次凍融:用精液冷凍保護液稀釋精液分裝于0.5 mL細管中,放入液氮冷凍保存。用時60 ℃解凍,吸取2 μL放置到準備好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盤中備用。然后再離心沉淀，用BTS重懸至精子濃度為1×106個/mL,吸取2 μL放置到準備好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盤中備用。

1.4單精子顯微注射受精(ICSI) 將精子加入ICSI培養皿中,選擇一條活動力強、形態正常的精子，用注射針在精子尾部中下段，于尾部垂直按壓，用力制動，將精子斷尾部后，頭部吸入注射針內，旋轉微調升起降下注射針，將卵母細胞的極體置于12點或6點處固定。調節注射針在3點處，并緊貼卵膜。旋轉針栓,將精子緩慢推向針頭，當精子到達末端時，小心進針避免將卵子后壁損壞。回吸少量卵漿，卵膜破裂后，將精子注入卵漿。若卵膜破裂仍不明顯，來回吸動卵漿，直到卵膜破裂后連同精子注入卵漿。精子注入卵漿內之前,必須抽吸少量卵漿,促進流入,增進卵母細胞激活。注射精子后，移出注射針，釋放卵子，持卵針離開液滴，注射針離開皿底部。

1.5ICSI卵母細胞激活處理 注射卵在胚胎培養液滴中洗 3 遍后置于培養箱中培養 30 min，再依據實驗設計對注射卵采用不同的輔助激活方法分四組處理：對照組，不激活；電激活組，采用 1.2 kV/cm，30 μs，2 次直流電(DC)脈沖；化學激活組，ICSI操作的卵子放入到添加了2 mol/L的6-DMAP作為激活劑的培養液中培養6 h；電+化學激活組，ICSI電激活后，在NCSU-23中培養4 h，然后轉入到添加了2 mol/L的6-DMAP作為激活劑的培養液中培養6 h。

1.6計算胚胎體外培養及發育率 金華豬ICSI卵母細胞培養于NCSU-23胚胎培養液中，培養條件為 38.5 ℃，5% CO2、及飽和濕度的CO2培養箱中培養。第2 d 統計卵裂胚胎數,第7 d再次進行觀察，統計囊胚發育情況。

1.7數據分析 用Graphpad Prism 5軟件，對試驗數據進行單因素方差分析。

2 結果

2.1不同激活方法對金華豬ICSI胚胎發育的影響 由表1可知，不同激活處理組與對照組比較，在卵裂率上無顯著差異(P>0.05)，但在囊胚率上，電+化學激活組和電激活組與對照組和化學激活組比較，存在顯著差異(P<0.05)。電+化學激活組和電激活組在囊胚率上無顯著差異 (P>0.05)，對照組和化學激活組在囊胚率上無顯著差異 (P>0.05)。

表1 不同激活方法對金華豬ICSI胚胎發育的影響

注：同列數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0．05)，肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2精子不同處理方法對豬ICSI胚胎發育的影響 由表2可知，新鮮精子和冷凍精子經ICSI后卵子在卵裂率、囊胚率上無顯著差異(P>0.05)。

表2 精子不同處理方法對金華豬ICSI胚胎發育的影響

注：同列數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

目前，常用的激活方法有化學激活和電激活，通常電激活與化學物質6-DMAP等聯合應用，其激活效果更好。6-DMAP是一種蛋白質磷酸化抑制劑，它能阻止蛋白質磷酸化，能抑制成熟促進因子(MPF)和細胞靜止因子(CSF)活性,從而使卵母細胞被激活,同時6-DMAP通過抑制紡錘體組裝必須的磷酸化，導致紡錘體解聚，抑制第二極體排出，使卵母細胞形成二倍體雌原核[6]。因此，在ICSI卵母細胞經電激活處理和6-DMAP激活處理之間，有一個適當的時間間隔，能夠有效的減少出現二倍體雌原核和孤雌發育的情況。電激活的原理是細胞在短暫高壓直流電脈沖的作用下，膜上產生暫時的微孔，使細胞外鈣離子通過微孔內流。Rho等研究表明，在ICSI卵經第1次激活后培養3 h后，再用6-DMAP處理,有利于第二極體的排出[7]。

本試驗先用電激活ICSI卵母細胞，在培養液中培養4 h后，此時大部分ICSI卵母細胞已排出第二極體，再用6-DMAP激活，促進了原核的形成，并有效的避免了6-DMAP對第二極體排放的抑制作用，得到了較高的囊胚率。結果顯示：新鮮精子和冷凍精子經ICSI后卵子在卵裂率、囊胚率上無顯著差異(P>0.05)。電+化學激活組和電激活組與對照組和化學激活組比較，在囊胚率上均差異顯著(P<0.05)。電+化學激活組在囊胚率上稍高于電激活組，但無顯著差異 (P>0.05)，都可用于金華豬ICSI卵子激活的方法。